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1、第十五章 微生物的培养与应用,高考考法突破,考法1 微生物的培养与纯化,应试基础必备,考点40 微生物的培养、分离及计数,考法2 微生物的分离、筛选与计数,应试基础必备,(1)培养基 概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养物质。 成分：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，还需满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。 培养基的制备：计算称量溶化灭菌倒平板。 (2)无菌技术 关键：防止外来杂菌的入侵。 方法：实验室中常用紫外线或化学药物消毒，如用酒精擦拭双手；灭菌的方法主要有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。,1微生物的培养,(3)实验操作 制备固体培养基
2、a步骤：计算称量溶化灭菌倒平板。 b倒平板操作时待培养基冷却至50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。 纯化菌种 a原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。 b方法：平板划线法、稀释涂布平板法。 菌种的保藏 a临时保存：固体斜面培养基上4 保存，菌种易被污染或产生变异。 b甘油保存：甘油瓶中20 冷冻箱中保藏。,2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (1)筛选菌株 原理：人为提供有利目的菌生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。 (2)统计菌落数目的方法 显微镜直接计数法 a.原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的
3、样品中微生物的数量。 b.方法：用计数板计数。 c.缺点：不能区分死菌与活菌。,间接计数法(活菌计数法) A原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中大约含有多少活菌。 B计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。 C操作 a设置重复组，增强实验的说服力与准确性。 b为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。 (3)实验流程：土壤取样制备培养基微生物的培养与观察细菌的计数。,3培养基对微生物的选
4、择作用,(1)纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，具有催化分解纤维素的作用，其作用过程如下： (2)纤维素分解菌的筛选原理 以纤维素作为唯一碳源的选择培养基上，刚果红纤维素红色复合物，纤维素分解菌可分泌纤维素酶，分解纤维素使红色消失，出现透明圈。即：可根据透明圈来筛选纤维素分解菌。 (3)土壤中纤维素分解菌的筛选流程 土壤取样(要在富含纤维素的环境中取样)选择培养梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。,高考考法突破,考法1 微生物的培养与纯化,(1)培养基的成分,(2)培养基的分类,(3)培养基的配制原则,目的要明确：根据微生物的种类
5、、培养目的等选择原料配制培养基，如培养自养型的微生物就不用加入有机营养物质。 营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。 pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。,注意：自养微生物与异养微生物类型划分的主要依据：能否以无机碳作为生长的主要或唯一碳源，而与氮源无关。两者所用培养基的区别可总结如下： 微生物最常用的碳源和氮源：最常用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常用的氮源是铵盐和硝酸盐。对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源。 琼脂的作用：加入培养基中的琼脂只能起到凝固作用，一般不能被微生物利用。,（1）自然环境中微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物是对其研究
6、和利用的前提，其基本原理：首先采用一定的方法将单个的细胞与其他细胞分离，进而提供细胞适宜的营养和条件，使其生长成为可见的群体。 （2）微生物的分散主要采用稀释的方法，而固体培养基能够使分散的细胞固着与一定的位置，与其他的细胞分离，从而生长成为一个单细胞来源的群体即纯培养物。,课标全国理综201639，15分某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题： （1）分离纯化乳酸菌时，首先需要用 对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是 。 （2）推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有 和
7、 。分离纯化时应挑选出 的菌落作为候选菌。 （3）乳酸菌在-20 长期保存时，菌液中常需要加入一定量的 （填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”）。,【解析】 （1）分离纯化乳酸菌需采用稀释涂布平板法，在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基上形成单菌落。为避免引入杂菌，必须用无菌水进行稀释。 （2）据题意可知，只有乳酸菌能产生乳酸溶解碳酸钙，加入碳酸钙的培养基可作为鉴别培养基，便于对乳酸菌进行筛选鉴定；此外，加入碳酸钙也可中和产生的酸，有利于乳酸菌的生存。 （3）细胞冷冻保存时，加入保护剂甘油可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，可避
8、免因细胞的机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等因素导致细胞死亡。,【答案】 （1）无菌水泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落 （2）鉴别乳酸菌中和产生的乳酸（或酸） 具有透明圈 （3）甘油,考法2 微生物的分离、筛选与计数,高考考法突破,（1）分离原理 利用分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，使其成为一种加富（或营养）培养基。 利用分离对象对某种物质的抗性，在培养基中加入抑制物，原来占生长优势的微生物受抑制，而分离对象则占生长优势，从而使其得到分离。,（2）常见的分离微生物的方法 改变培养基中的营养成分，如培养基中缺乏氮源时，可
9、以分离固氮微生物，利用富含纤维素的培养基分离纤维素分解菌；在尿素为唯一氮源的培养基中，分离尿素分解菌等。 当培养基中加入抗生素时，如加入青霉素、链霉素，可以抑制细菌的生存，从而分离出真菌等真核微生物。,（1）利用透明圈筛选微生物 抗生素与透明圈的关系： 用含抗生素的滤纸片均匀置于平板培养基上的不同位置，某种细菌形成的透明圈越大，说明该细菌对该抗生素越敏感，抗生素抑菌能力越强。若不出现透明圈，说明该细菌对该抗生素不敏感。 分解圈（或透明圈）的大小与降解能力的关系： 在固体培养基中加入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。接种培养后待筛选的菌落周围就会形成分解圈（或透明
10、圈），分解圈（或透明圈）的大小反映了菌落利用此物质的能力。常作为初步筛选菌落的快速方法。如在培养基中加入可溶性淀粉、酪素或原油可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或降解原油能力的大小。,（2）菌株筛选原理的比较,（1）直接计数法常用的是显微镜直接计数法（利用特定细菌计数板或血细胞计数板）。该方法所需设备简单，可迅速得到结果，而且在计数的同时能观察所研究微生物的形态特征。但不能区分死细胞与活细胞，应用范围狭窄，样品中菌液浓度不能低于106个/ml，难以计数微小的细菌。 （2）间接计数法（活菌计数法） 原理：常用稀释涂布平板计数法，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释
11、液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。 计数规则：实验时，每一浓度至少涂布3个平板，以增强实验的说服力和准确性。选择菌落数在30300间的平板进行计数。 计算方法：每克样品中的菌株数=(CV)M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。,注意：细菌培养和计数方法的易失分点 稀释涂布平板法：分离细菌，也能计数（结果偏小） 平板划线法：只能纯化细菌，不能计数。 显微计数法：不能区分细菌死活（结果偏大）,课标全国理综201737，15分某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。 回
12、答下列问题： （1）有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_（答出两点即可）。 （2）为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_（填“尿素”“NH4NO3”或“尿素+NH4NO3”）作为氮源，不选择其他两组的原因是_。 （3）用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_（答出两点即可）。,【解析】 （1）题中要从土壤中分离出产脲酶细菌，所用的选择培养基应以尿素为唯一氮源，要鉴别尿素分解菌，可在培养基中加入酚红指示剂，产脲酶细菌
13、在该培养基上生长一段时间，由于产生的脲酶分解了尿素，产生氨，使培养基pH升高，所以菌落周围的指示剂变成红色。 （2）依据题意“均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，可知该过程采取的接种方法是稀释涂布平板法；根据计算公式：每克样品中菌株数=（CV）M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数，为使结果接近真实值，一般选择菌落数在30300的平板进行计数，菌落数为13和462的平板应舍弃，所以每克土壤样品中的细菌数量为（156+178+191）30.1105=1.75108个；因为稀释涂布平板法计数过程中，可能出现两个或多个
14、细菌连在一起只形成一个菌落的情况，所以利用稀释涂布平板法统计的菌落数要比血细胞计数板计数法得到的数值低。 【答案】（1）尿素 酚红 红 （2）稀释涂布平板法 1.75 少,高考考法突破,应试基础必备,考点41 传统发酵技术的应用,应试基础必备,1.果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作,2.影响腐乳品质的因素 （1）盐：a.浓度过低，不足以抑制微生物生长，豆腐易腐败变质。b.浓度过高，会影响腐乳口味。 （2）酒的含量：一般控制在12%左右。 （3）香辛料：具调味、杀菌作用。,（1）危害：当摄入总量较多时，可引起中毒或死亡。在特定条件下，亚硝酸盐可以转变成致癌物亚硝胺。 （2）原理：在盐酸酸化条件下，亚硝
15、酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。 （3）检测步骤：配制溶液制备标准显色液制备样品处理液比色。,3亚硝酸盐含量的测定,高考考法突破,(1)酵母菌与果酒的关系：酵母菌有氧呼吸时，产生能量多，产物为二氧化碳和水，可大量繁殖；无氧呼吸时，产生能量少，产物为酒精和二氧化碳，仅能满足自身代谢，基本不繁殖，所以用酵母菌进行工业生产果酒时先进行通气，再密闭。 (2)醋酸菌与果醋的关系：醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再进一步转变为醋酸。,考法3 果酒和果醋的制作方法及应用,选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，再除去枝梗，以防葡萄汁流失以及污染。冲洗以洗去灰尘为目的，不要太干净，以防洗去野生酵母菌。,(1)榨汁机要清洗干净并晾干。 (2)发酵瓶要洗净并用体积分数为70%的酒精消毒。 (3)装入葡萄汁后要封闭充气口。,(1)葡萄汁装入发酵瓶时，要留约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；防止
