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1、microRNA 与肺癌的关系研究进展胡亚峰按照稿约填写你的资料、单位、地址、电话等。“北京医学”要求 3500 字，你看完把意见给我，我再改改。引言自 2003 年 Ambros 等首次在线虫中发现首个 microRNAlin-4，并发现其时序性调控线虫发育的功能后，众多的研究者对这一新的调控分子进行了广泛而深入的研究，发现了多个 microRNA。作为非编码 RNA 的成员，成熟microRNA 是一类长度 2123 核苷酸的内源调控性小 RNA 分子，通过与靶基因的 3非编码区（3UTR）互补结合，以对靶 mRNA 剪切和抑制蛋白质翻译的方式负性调控靶基因。目前已知 microRNA 可
2、以调节约 50%的蛋白编码基因，包括发育、分化和凋亡等生理过程和炎症、肿瘤、心血管疾病等病理过程均有microRNA 的参与。在所有肿瘤之中，肺癌的死亡率居首位。尽管有关肺癌的早期诊断技术、化疗和靶向治疗不断革新，肺癌的 5 年存活率依旧较低，复发率较高。对肺癌生物学有限的了解是影响其预后的主要原因。近年出现的 microRNA 与肺癌关系的研究丰富了对肺癌发生、发展等机理的认识，为肺癌早期诊断、基因药物的研发和判断预后提供了可靠的理论基础。本文对 microRNA 与肺癌的关系进行了综述。1 microRNA 概述microRNA 是一类长度为 2023 核苷酸的非编码 RNA 分子，存在于
3、多种生物的基因组中，在转录后水平以序列特异性调节的方式调控基因表达。成熟microRNA 的形成包含以下步骤：microRNA 基因由 RNase转录为 pri-microRNA 的初级转录产物，在细胞核内由称为 Drosha 的 RNase对其进行第一次剪切成为带有茎-环结构的长约 70 个核苷酸的 microRNA 前体pre-microRNA，随后在细胞浆中由 Dicer 酶催化其第二次剪切形成成熟microRNA。其中还有若干重要蛋白、因子，如 DGCR8 蛋白、Exportin5 因子等的辅助才可准确生成成熟 microRNA。成熟 microRNA 选择性整合入 RNA 诱导的沉默
4、复合物（RNA induced silencing complex，RISC ）中识别靶基因，其与靶基因完全互补时会引发靶 mRNA 的降解，与靶基因互补程度较低时引起mRNA 翻译的抑制。microRNA 及其调控的靶基因的表达构成一个调控网络，动态调控生物体各种生物学过程的运行。通过杂交、聚合酶链反应及基因芯片等方法检测microRNA 在不同生理、病理状况下的表达状况，于体内、外水平对差异microRNA 进行过表达和抑制表达以观察组织、细胞等表型变化，利用生物信息学分析结合报告基因系统及其他分子生物学技术进行验证成为 microRNA 研究的主要策略。由于作用机制的特殊性，使得单个 m
5、icroRNA 可以调控多个靶基因或多个 microRNA 共同调控同一靶基因存在可能，因此经过确认的microRNA-靶基因配对仅揭示 microRNA 调控网络的一部分。2 microRNA 通过调控不同的靶基因在肺癌发生过程中所发挥的功能肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，死亡率很高。其发生机制复杂，目前尚未完全明确。作为生物体重要的一类调控分子，microRNA 在肺癌中存在失控表达。自 let-7 簇被发现差异表达并且在肺癌发生、发展具有重要功能以来，microRNA 引起人们极大兴趣，多个研究小组对与肺癌密切相关的众多microRNA 进行了研究，对其靶基因和功能有了基本的了解。
6、我们选取若干具有特征性的 microRNA 进行综述。2.1 let-7 簇let-7 簇最早发现于线虫，与分化、发育密切相关。人 let-7 序列与线虫高度保守，有多个成员，某些成员的基因恰位于肿瘤缺失的基因区域。Takamizawa 1等最先利用 Northern Blot 检测多个肺癌细胞系及 143 例非小细胞肺癌（nonsmall cell lung carcinoma，NSCLC ）的治疗性切除标本中 let-7 簇的表达，发现 60%细胞系中 let-7 簇 的低表达，44%临床标本中 let-7 簇表达水平下降80%，对肺癌病人进行 5 年随访发现，除肺癌分期外，let-7 簇
7、各亚型的低表达是影响肺癌切除病人存活率的独立预测因子，此外，在 A549 肺腺癌细胞系过表达Let-7 抑制了肺癌细胞的生长。let-7 簇的靶基因众多，包括 RAS, HMGA2, IMP-1 等（表 1）。作为肺癌重要的原癌基因，RAS 基因产物通过调控基因转录激酶进而调节细胞生长和分化，其突变是众多肿瘤发生的原因。let-7 簇通过与 N-RAS 和 K-RAS 的 mRNA3UTR 互补结合调控 RAS 表达，肺癌组织 let-7 簇的低表达解除了对 RAS 的负调控进而导致肿瘤发生2 。 HMGA 是非组蛋白的染色体蛋白的重要成员，参与分化和发育相关的转录调控，HMGA2 通过引起染
8、色质易位而导致肿瘤发生。Kumar 3等发现过表达 let-7 簇的 NSCLC 细胞周期停滞和死亡，肿瘤细胞异位移植于过表达 let-7 簇小鼠表现出肿瘤的生长抑制，NSCLC 细胞生长抑制主要是 let-7 带来的 HMGA2 降低引起。目前已经证实的 let-7 簇靶基因还有很多，这些已经确定的 let-7 簇-靶基因配对明确了 let-7 簇的肿瘤抑制作用。1.2 mir-17-92 簇mir-17-92簇包含多个成员，位于C13orf25基因的内含子区域，成熟mir-17-92簇过表达于肺癌组织，特别是小细胞肺癌（small cell lung carcinoma，SLC）。对NSC
9、LS细胞进行包括mir-17-5p和mir-20a 的mir-17-92簇反义寡核苷酸处理降低了它们的表达，引起显著的凋亡效应，进一步功能研究发现缺氧诱导因子（HIF） -1mir-17-92簇的靶基因表达升高是引起凋亡的原因。HIF-1 是氧依赖的转录因子的一种，具有转录激活某些与凋亡、代谢、增殖和侵袭等基因的作用。而且，癌基因c-myc 可以通过结合于C13orf25 基因的启动子区域转录激活mir-17-92簇，表达增高的 mir-17-92簇引起HIF-1的降低，进而引起凋亡抑制、细胞周期停滞失效等作用，而引起肿瘤发生4。1.3 mir-34上皮-间充质转化（EMT ）是上皮细胞在某些
10、通路作用下转换为具有间质表型的细胞的过程，是上皮来源的恶性肿瘤获得迁移及侵袭能力的重要生物学过程。Snail1作为一种锌指蛋白转录抑制子，其异常表达与EMT过程密切相关。在肺腺癌细胞，当抗癌基因p53 突变或失去功能时，失去抑制的Snail1会引发EMT，其原因是 mir-34表达水平的降低。mir-34 的靶基因不仅包括 Snail1，还有Snail1的调控分子如：-catenin、LEF1等5，这凸显了mir-34在P53基因突变的肺癌侵袭和转移中的作用。Cyclin E是细胞周期素依赖激酶CDK2的一个正相调节亚单位，Cyclin E作为mir-34c 的靶基因，与包括肺癌等多种肿瘤的发
11、生发展相关6 。2.4 表皮生长因子 EGFR 与 microRNAEGFR 作为 erbB 受体家族成员之一，广泛表达于人类各个组织，调控包括增值、分化和发育等细胞过程。EGFR 信号通路的异常是发生上皮来源肿瘤的重要原因。包括 mir-21 和 mir-125a-5p 的一些 microRNA 作为此通路的下游调控分子，在肺癌发生过程发挥重要作用。肺癌细胞中磷酸化的 EGFR 导致 mir-21 的高表达，EGFR 抑制剂显著降低 mir-21 的表达， mir-21 的反义寡核苷酸处理突变型肺腺癌细胞会增强 EGFR 抑制剂诱导的凋亡作用，处理野生型肺腺癌细胞时 mir-21 本身就可诱
12、导肺癌细胞的凋亡7 ，这些结果凸显了 mir-21 在EGFR 突变型及野生型肺癌中潜在药物靶点的作用。同样，mir-125a-5p 具有抑制肺癌侵袭和转移的作用，肺癌组织 EGFR 通路的 mir-125a-5p 的低表达与肺癌发生密切相关 8。2.5 microRNA 与单核苷酸多态性单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP ）是指不同个体基因在某一特定核苷酸位置存在单个不同碱基的现象，且其频率至少大于1%。SNP 不均匀分布于基因组中，在非编码序列的分布远多于蛋白编码序列。发生在 pre-microRNA 的 SNP 将会改变成熟 microR
13、NA 的加工、表达和与靶基因的结合，如此导致对某些肿瘤的易感性或侵袭性的改变。Hu 9等人发现miR-196a2 的 SNP（re11614913）与 NSCLC 的存活率紧密相关，此位点上是纯合子 CC 的病人存活率显著降低，对 miR-196a2 与其包括 KIF20A、DHFR 等靶基因结合实验发现 SNP 影响其与靶基因的集合。随后进行的对照研究10发现纯合子 CC 相比于纯合子 TT 及杂合子 TC，具有显著增加肺癌发生的风险。2.6 肺癌耐药相关 microRNASCLC 占所有肺癌的 15%，尽管对放化敏感，部分病人依旧由于药物抵抗而癌症复发或预后不良。癌症病人对药物抵抗的机理十
14、分复杂，包括药物本身的转运、代谢，DNA 合成及修复等。具有转录后调控机制的 microRNA 通过多种机制参与肺癌的耐药。Guo11等通过 microRNA 芯片和 cDNA 芯片比较化疗敏感 NCI-H69 及不敏感 NCL-H69AR 细胞系（SCLC）在阿霉素作用下microRNA 和 mRNA 表达谱的变化，通过两者的负相关关系，确定与药物抵抗相关的 microRNA 群，对具有显著性差异的 mir-134 簇（包括 mir-134/379/495等）进行功能分析发现：mir-134 的靶基因是具有药物抵抗作用的转膜糖蛋白MRP1/ABCC1，并且具有使细胞周期停滞于 G1 期的作用
15、，mir-134 在肺癌当中的下调准确解释了 NCL-H69AR 细胞系耐药的原因。Ranade12等通过观察SCLC 标本 microRNA 表达状况并与与临床结合观察耐药与预后的关系发现：mir-92a-2 与化疗耐药紧密相关，只有性别和 mir-92a-2 高表达与生存率相关，由此揭示了 mir-92a-2 与肺癌耐药的关系。2.7 血清 microRNA 与肺癌2008 年，Chen 发现血清中存在稳定的成熟 microRNA，这些 microRNA 十分稳定，可以抵抗 RNA 酶的消化。通过测序技术并在肺癌病人和正常对照组进行 PCR 验证发现 mir-25 和 mir-223 在血
16、清中存在特异表达。Hu 13等通过比较 60 个具有不同生存期的 NSCLC 病人血清 microRNA 表达并在 243 个病人中验证发现包括 mir-486，mir-30d，mir-1 和 mir-499 与 NSCLC 病人总生存率密切相关。类似地，Foss14 等通过对早期 NSCLC 病人与正常对照组血清microRNA 进行比较分析发现 mir-1254 和 mir-574-5p 在肺癌病人血清中显著增高，进行验证发现这两个 microRNA 分别有 73%和 71%的敏感性和特异性。在血清中 microRNA 的来源及其释放入血的机制至今尚未完全阐明。来源于肺癌组织的微粒体可能是血清 microRNA 的来源。某些 microRNA 在微粒体以远高于肺癌细胞的浓度存在暗示了 microRNA 的来源可能是肺癌组织。但是肺癌组织异常表达的 let-7 家族、 mir-137 等并未在血清中观察到异常表达。这些microRNA 的血
