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1、1重症急性胰腺炎大鼠 IL-8 IL-10 及 NF-B 的表达作者：金牡丹 周智林 傅志泉【摘要】目的 通过观察重症急性胰腺炎（SAP）大鼠白介素-8（IL-8） 、白介素-10（IL-10）及胰腺 NF-B 的表达，探讨重症急性胰腺炎的发生发展机制。方法 将 40 只大鼠随机分为正常对照组（假手术组） 、模型组（重症急性胰腺炎组） ，每组 20 只，造模后 24h 测定血淀粉酶、IL-8 及 IL-10，切取相同部位的胰腺组织观察组织病理学改变，进行 NF-B 的免疫组织化学染色。 结果 模型组大鼠血清淀粉酶、IL-8 及 IL-10 的浓度均显著高于对照组，模型组 NF-B免疫组化染色较
2、对照组显著增强。 结论 IL-8、IL-10 及 NF-B 在重症急性胰腺炎的发生发展中起重要作用，重症急性胰腺炎的早期即有胰腺组织 NF-B 的活化。 【关键词】 重症急性胰腺炎 白介素-8 白介素-10 核因子-B【Abstract】 Objective To investigate the expression of nuclear factor-kappa B (NF-B), serum interleukin-8 (IL-8) and interleukin-10 (IL-10) in severe acute pancreatitis (SAP) in rats .And to i
3、nvestigate the roles of activated nuclear factor-kappa B (NF-B) and serum IL-8 and IL-10 in SAP. Methods 40 Wistar rats were randomly divided into normal control group (Sham operation group) and model group (SAP group). There were 20 rats in each group. Levels of serum amylase, IL-8, IL-10 and activ
4、ated NF-B in the pancreatic tissue were detected 24 hours after operations. Results The levels of IL-8 and IL-10 in serum SAP were significantly higher than those in normal control group. Activated NF-B was enhanced in SAP group compared with Sham operation group. Conclusions IL-8, IL-10 and NF-B pl
5、ay an important role in severe acute pancreatitis. There was activated NF-B at the early stage of severe acute pancreatitis.【Key Words】 Severe acute pancreatitis Interleukin-8 Interleukin-10 Nuclear factor-kappa B重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）是由多因素诱发、多个脏器受累、病情凶险、发展迅速、病死率高的内科急重症，而多器官功能障碍综合征（
6、multiple organ dysfunction syndrome, MODS）或者多器官功能衰竭（multiple organ failure, MOF）是 SAP 的主要死亡原因。损伤因子（如异常激活的胰酶）导致各种炎症细胞的过度激活，形成亢进的免疫反应，并释放多种炎性介质，启动全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome, SIRS） ，在机体受到促炎细胞因子损伤引起 SIRS 的同时，机体的防御系统也随之发生反应,合成并释放抗炎细胞因子，引起代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti-inflammatory re
7、sponse syndrome, CARS) 。无论失控的 SIRS，还是过度的 CARS，均表现为机体致炎-抗炎因素的失衡，机体稳态破2坏，均可导致炎症损害加重。在 SAP 时，大量细胞因子产生，促炎因子和抗炎因子共存，其中包括促炎细胞因子 IL-8 和抗炎细胞因子 IL-10 。核因子-B（nuclear factor kappa B, NF-B）活化是众多炎症介质作用机制的共同通道，诸多炎症因子在基因水平上都受到 NF-B 的调控。作者自 2006 年 8 月至2007 年 3 月通过建立大鼠重症急性胰腺炎模型，观察血清中 IL-8、IL-10 的变化以及胰腺 NF-B 的表达，探讨重症
8、急性胰腺炎的形成机制。1 材料和方法1.1 动物及分组40 只 Wistar 大鼠（购自浙江省医学科学院） ，体重 250300g，随机分为正常对照组（假手术组） 、重症急性胰腺炎组（模型组） ，每组 20 只。各组于术后24h 全部处死，留取标本。动物饲养：所有大鼠均给予普通饲料喂养，自由饮水，饲养环境为每笼 4 只，人工光循环 12h/12h，温度为(212.0)，湿度为(552)%。1.2 化学试剂兔抗鼠的 NF-B 单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司, 大鼠血清IL-8 和 IL-10 的 ELISA 试剂盒购自 R&D systems。1.3 重症急性胰腺炎模型的制备大鼠术前禁食
9、、不禁水 12h，以 10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg） 。无菌条件下取上腹正中切口入腹，寻找胆胰管十二指肠乳头开口，使用一次性静脉留置套管针于对系膜缘肠壁穿刺，进入肠腔后即将针芯退出，将套管经乳头部逆行插入胆胰管约 1cm，以无损伤小动脉夹于肝门部阻断胆管后，套管末端接微量泵，以 0.1ml/min 的速度匀速注入 5%牛磺胆酸钠（1ml/kg 体重） ，注毕后拔管，胰腺组织可在短时间内出现充血、水肿，可见包膜下胰腺组织点状或小片状出血，5min 后去除小动脉夹，以无损伤缝线缝合肠壁穿刺孔处，关腹。对照组大鼠开腹后仅翻动胰腺数次后关腹。1.4 取材方法大鼠造模后 24h 以 10
10、%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，经心脏取血，测定血淀粉酶、IL-8 及 IL-10；切取相同部位的胰腺组织。1.5 分光光度法检测血清淀粉酶1.6 血清 IL-8 及 IL-10 测定（ELISA 法）洗涤液用重蒸水 1:20 稀释。底物工作液配制：使用前将 OPD 片放入底物稀释中溶解，每片加液 5ml。标准品液配制：使用前每管中加入蒸馏水 200l 溶3解。试剂盒设标准孔 8 孔，每孔中各加入样品稀释液 100l，第 1 孔加标准品100l，混匀后用加样器吸出 100l，移至第 2 孔，如此反复作对倍稀释至第7 孔，最后，从第 7 孔中吸出 100l 弃去，使之体积均为 100l，第 8 孔
11、为空白对照，建立标准曲线。待测品孔各加入待测样品 100ml。将反应板充分混匀后置 37 120min。用洗涤液将反应板充分洗涤 5 次，向滤纸上印干。每孔加第一抗体工作液 1 滴，将反应板置 37 60min。同前洗板。每孔加酶标抗体工作液2 滴，将反应板置 37 60min。同前洗板。每孔加入底物工作液 2 滴，置 37暗处反应 10min。每孔加入 1 滴终止液混匀。在 492nm 处测吸光值。以标准品1000、500、250、125、62、31、 16、0pg/ml 之 OD 值在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 IL-8 及 IL-10 含量。1.
12、7 病理学检查、NF-B 测定每个标本切片行 HE 染色，采用盲法由专科医师在光镜下阅片，每张切片随机选择 5 个高倍视野，观察胰腺组织病理变化。NF-B 免疫组织化学染色，胰腺腺泡细胞及胰岛细胞染色为棕黄色的是 NF-B 阳性细胞，以积分法半定量描述所取标本的染色情况，每张切片随机观察 10 个高倍视野，按染色强度分为 4级：0 =阴性染色；1=弱阳性染色；2=中度阳性染色；3=强阳性染色；按阳性细胞数占总细胞数的比例分为 5 级：0=阴性；1=阳性细胞 1%25%；2=阳性细胞26%50%；3=阳性细胞 51%75%；4=阳性细胞 76%100%；每张切片的染色积分以这二者乘积之和表示。1
13、.8 统计学处理实验结果以(xs)表示，用 SPSS 12.0 统计软件进行分析，首先进行方差齐性检验，然后进行单因素方差分析。2 结果2.1 血清淀粉酶，IL-8 及 IL-10 的变化模型组大鼠血清淀粉酶、IL-8 及 IL-10 的浓度均显著高于对照组，差异有统计学意义。见表 1。表 1 各组大鼠血清淀粉酶、IL-8、IL-10 及 NF- B 水平（略）2.2 各组大鼠胰腺的组织病理学变化胰腺组织学改变：对照组胰腺组织光镜下各时段无明显改变，胰腺腺泡细胞排列紧密，可见胰岛，无中性粒细胞浸润；模型组则见间质水肿，大片腺泡细胞变性坏死，伴有大量粒细胞浸润。对照组大鼠胰腺组织 NF-B 免疫
14、组织化学染色，腺泡细胞未见阳性细胞，胰岛细胞的胞浆呈淡黄色；模型组可见多数胰腺腺泡细胞胞浆呈棕黄色，胰岛细胞胞浆呈棕黄色，部分胰岛细胞的胞核亦呈棕黄色，染色范围较对照组明显增大，染色强度较对照组明显增强，结果有统计学意义（见表 1、图 14） 。43 讨论急性胰腺炎是常见急腹症，约 10%15%发展为重症急性 SAP。其最直接的原因是病程早期出现严重的 SIRS 及其它系统并发症，如急性呼吸窘迫综合征和MODS。诸多研究己证实炎症细胞过度激活及炎性细胞因子的过度表达导致细胞因子网络失衡在 SAP 中起着关键性作用，并同上述并发症密切相关。NF-B 活化是众多炎症介质作用机制的共同通道，诸多炎症
15、因子在基因水平上都受到 NF-B 的调控。NF-B 是一种具有多向转录调节作用的蛋白，p50/p65 异源二聚体是 NF-B 活化的最常见形式。生理情况下 NF-B 同其抑制因子（inhibitor of NF-B, IB）结合以无活性状态存在于细胞浆内；疾病过程中，多种因素如病毒、内毒素、氧自由基、TNF-a、IL-6、IL-8 等均可使其激活，NF-B 由胞浆进入核内，与其靶基因上的启动子或增强子结合，进而调控多种细胞因子和免疫介质的表达，进一步放大炎症反应，促炎因子和抗炎因子共存,其中包括促炎细胞因子 IL-8 和抗炎细胞因子 IL-10 。1997 年 Dunn 等首先发现 NF-B
16、的活化是 AP 发生中的重要早期事件，随后 Altavilla 等发现雨蛙素诱导的大鼠水肿性 AP 胰腺组织中 NF-B 的活性在疾病的早期有明显的升高。Osman 等把 IL-10 类似剂应用于实验性AP 动物模型后，发现血清 TNF-a 和 IL-8 水平下降，腹水量减少，中性粒细胞浸润和趋化以及肺组织 CD11B/CD18 阳性细胞功能明显受到抑制，生存率明显改善。在体外试验中，Olivier发现 IL-10 可以通过抑制 IB 激酶复合体来抑制NF-B 的活性，从而减少支气管上皮细胞中 IL-8 的表达。本研究表明在重症急性胰腺炎的早期胰腺组织即有 NF-B 的活化，IL-8，IL-10 及 NF-B 在重症急性胰腺炎的发生发展中起重要作用，重症急性胰腺炎时机体致炎-抗炎因素失衡，IL-10 可能有助于促进致炎-抗炎因素的平衡，减轻重症急性胰腺炎时的炎症反应。【参考文献】1 Bon
