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1、第2讲 微生物的培养与应用,知识清单,一、微生物的实验室培养 1.培养基 (1)概念:人们按照微生物对 营养物质 的不同需求,配制出供其生长繁殖的 营养基质 。,知识清单,2.无菌技术 (1)含义:指在培养微生物的操作中,所有防止 杂菌污染 的方法。 (2)关键:防止 外来杂菌 的入侵。,知识清单,3.大肠杆菌的纯化培养 (1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基: 计算 称量 溶化 灭菌 倒平板 (2)纯化大肠杆菌: 纯化培养原理:在培养基上将细菌稀释或分散成 单个细胞 ,使其长成单个菌落,此菌落就是由一个细胞繁殖而来的纯化的细菌菌落。 纯化大肠杆菌的关键步骤: 接种 。 常用的微生物接种方法: a.
2、平板划线法:通过 接种环 在琼脂固体培养基表面 连续划线 的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。 b. 稀释涂布平板 法:将菌液进行一系列的 梯度稀释 ,然后将 不同稀释度 的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。,知识清单,(3)菌种的保存方法: 对于频繁使用的菌种,可以采用 临时保藏 的方法。 对于需要长期保存的菌种,可以采用 甘油管藏 的方法。 二、微生物培养技术的应用 1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (1)菌种筛选:使用 尿素 是唯一氮源的选择培养基培养。 (2)统计菌落数目:常用方法有 稀释涂布平板法 、显微镜直接计数法。 (3)细菌分离与计数的实验流程:土壤
3、取样 配制培养基 微生物的培养与观察细菌的计数。,知识清单,2.分解纤维素的微生物的分离 (1)纤维素酶: 组成:一种复合酶,它至少包括三种组分,即 C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶 。 (2)筛选方法: 方法:刚果红染色法,即通过是否产生 透明圈 来筛选纤维素分解菌。 培养基:以 纤维素 为唯一碳源的选择培养基。,知识清单,(4)实验流程: 土壤取样:富含 纤维素 的环境 选择培养:用选择培养基培养,以增加纤维素分解菌的数量 梯度稀释 涂布平板:将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上 挑选产生透明圈的菌落:产生 纤维素酶 的菌落周围出现透明圈,知识清单,1.培养基的制备包括计算、称量、溶化、灭菌、
4、倒平板等步骤,倒平板操作中,平板冷凝后倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。 2.纯化大肠杆菌的方法包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线,稀释涂布平板法要求菌液要充分地稀释。 3.微生物的计数要求制作多个平板,且每个平板上能长出30300个菌落。 4.纤维素酶包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。,考点二,考点一,考点四,考点三,考点一 培养基的类型及配制 1.培养基中的营养成分 培养基一般都含有水、无机盐、碳源、氮源等,此外还需要满足微生物生长对pH、特殊的营养物质以及氧气的要求。如培养乳酸杆菌时需添加维生素。,考点二,考点一,考点四,考点三,考点二,考点一,考
5、点四,考点三,2.培养基的种类及应用,考点二,考点一,考点四,考点三,考点二,考点一,考点四,考点三,3.培养基的制备:计算称量溶化灭菌倒平板。,考点二,考点一,考点四,考点三,典例1 下列有关细菌培养的叙述,正确的是 ( ) A.在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌 B.在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长 C.向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长 D.用固体培养基可对微生物进行分离 【解题思路】单个菌落中只含有一种细菌;青霉素能抑制细菌生长,而对真菌没有影响;破伤风杆菌是厌氧型细菌,通入氧气会抑制其生长。 【参考答案】 D,考点二,考点一,考点四,考点三,1.(20
6、15泰州一模)下列关于制备牛肉膏蛋白胨培养基的叙述,错误的是 ( D ) A.培养基应先调pH再进行灭菌 B.培养基应先灭菌再分装到培养皿 C.溶化琼脂时不能使培养基溢出或烧焦 D.高压蒸汽灭菌锅加盖时应按顺时针方向依次旋紧螺栓 【解析】培养基制备的流程为计算称量溶解调pH值过滤分装包扎标记灭菌摆斜面或倒平板,A、B项正确;溶化琼脂时不能使培养基溢出或烧焦,否则将影响培养的效果,C项正确;高压蒸汽灭菌锅加盖时应同时旋紧相对的两个螺栓,D项错误。,考点二,考点一,考点四,考点三,2.(2015深圳二模)关于微生物培养基的说法正确的是 ( B ) A.牛肉膏不能提供碳源 B.培养硝化细菌不加有机碳
7、 C.刚果红使纤维二糖染色 D.酵母菌酿酒时需持续供氧 【解析】牛肉膏能给微生物提供碳源,A项错误;硝化细菌属于自养型微生物,故培养时可以不加有机碳,B项正确;纤维素可以与刚果红染液反应呈红色,C项错误;酵母菌酿酒时前期需要供氧,后期应该是严格的无氧发酵(酵母菌无氧呼吸产生酒精),D项错误。,考点二,考点一,考点四,考点三,考点二 无菌技术 1.无菌技术的主要内容 (1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手,进行清洁和消毒。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 (3)为避免周围环境中微生物的污染,实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 (4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用
8、具与周围物品相接触。,考点二,考点一,考点四,考点三,2.消毒和灭菌的区别,考点二,考点一,考点四,考点三,考点二,考点一,考点四,考点三,典例2 (2015甘肃嘉峪关一中一模)微生物培养过程中,要十分重视无菌操作,现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作,防止杂菌污染,请分析,下列操作中错误的是 ( ) 煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢 接种操作要在酒精灯火焰附近进行 无菌繁殖脱毒苗时,植物的外植体要进行消毒 家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 培养基要进行高压蒸汽灭菌 加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌 A. B. C. D.,考点二,考点一,考点四,考点三,【解题思路】
9、无菌操作包括消毒和灭菌。生物学实验中需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等,需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢,属于消毒;为防止空气中杂菌污染,接种时要在酒精灯火焰附近进行;家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌,故不能灭菌;培养基常进行高压蒸汽灭菌。综上,操作错误。 【参考答案】 D,考点二,考点一,考点四,考点三,1.(2015江苏扬州中学质检)关于灭菌和消毒的叙述,错误的是 ( D ) A.接种环、接种针用灼烧的方法灭菌 B.灭菌是杀死物体内外所有微生物 C.消毒是杀死物体内外绝大多数的微生物 D.高压蒸汽
10、灭菌的原理是使细菌DNA变性 【解析】消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物;灭菌则是指使用强烈的物理因素杀死物体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子;微生物的接种工具(接种环、接种针等金属用具)用灼烧灭菌的方法灭菌;高压蒸汽灭菌的原理是使细菌的蛋白质凝固变性,从而杀死细菌。综上,D项错误。,考点二,考点一,考点四,考点三,2.消毒和灭菌是两个不同的概念,灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力。消毒仅指杀死一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害。下列适用于消毒处理的是 ( A ) 皮肤 饮用水 牛奶 注射器 培养皿 接种环 培养基 果汁 酱油 手术刀
11、 A. B. C. D.以上全部 【解析】消毒指用比较温和的方法杀死物体表面或内部的部分微生物。题中的皮肤、饮用水、牛奶、果汁、酱油适于用消毒的方法处理,而注射器、培养皿、接种环、培养基、手术刀等必须进行灭菌处理。,考点二,考点一,考点四,考点三,考点三 微生物的纯化培养平板划线法与稀释涂布平板法 1.纯化培养的基本原理 首先采用一定的方法将单个的细胞与其他细胞分离,进而提供细胞适宜的营养和条件,使其生长成为可见的群体。微生物的分散主要采用稀释的方法,而固体培养基能够使分散的细胞固着于一定的位置,使其与其他的细胞分离,从而得到由一个单细胞繁殖而来的子细胞群体,即纯培养物。,考点二,考点一,考点
12、四,考点三,2.纯化培养的接种方法,考点二,考点一,考点四,考点三,考点二,考点一,考点四,考点三,考点二,考点一,考点四,考点三,典例3 (2015南京三模)如图表示培养和纯化X细菌的部分操作步骤,下列有关叙述正确的是 ( ) A.步骤操作时,倒好平板后应立即将其倒置,防止水蒸气落在培养基上造成污染 B.步骤接种环和试管口应先在火焰上灼烧,接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液 C.步骤沿多个方向划线,使接种物逐渐稀释,培养后可根据出现的单个菌落计数 D.步骤是将培养皿放在恒温培养箱中培养,一段时间后所得到的都是X细菌的菌落,考点二,考点一,考点四,考点三,【解题思路】步骤操作时,倒好平板后应待其
13、冷却凝固后,再将平板倒置,A项错误;平板划线法不能用于计数,C项错误;开始划线时,菌落没有被完全稀释,会导致多个菌体聚集在一起形成菌落,D项错误。 【参考答案】 B,考点二,考点一,考点四,考点三,1.平板划线法和稀释涂布平板法是接种微生物的两种常用方法,下列描述正确的是 ( D ) A.都可对微生物进行计数 B.平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环连续划在固体培养基表面 C.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基上进行培养 D.都会在培养基表面形成单个的菌落 【解析】平板划线法不能对微生物进行计数,只能用于分离纯化微生物,计数微生物常采用稀释涂布平板法;平板划线法不需要进行梯度
14、稀释;稀释涂布平板法需要将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基的表面;平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个的菌落。综上,D项正确。,考点二,考点一,考点四,考点三,2.(2015江苏射阳中学月考)如图甲是稀释涂布平板法中的部分操作,乙是平板划线法的操作结果。 下列叙述中错误的是 ( C ) A.甲中涂布前要将涂布器灼烧,冷却后才能取菌液 B.对于浓度较高的菌液,如甲中的稀释倍数仅为102,则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成 C.乙中培养皿中所得的菌落都符合要求 D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端,考点二,考点一,考点四,考点三,【解析】灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触
15、菌种,会将菌体杀死,A项正确;稀释倍数过低会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落,B项正确;平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成的单菌落,C项错误;连续划线中,除了第一次划线外,每一次划线的起点都应是上一次划线的末端,目的是使得菌体密度越来越小,保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成,D项正确。,考点二,考点一,考点四,考点三,考点四 微生物的筛选与计数 1.筛选分解尿素的细菌与分解纤维素的微生物的比较,考点二,考点一,考点四,考点三,2.统计菌落数目的方法 (1)显微镜直接计数法: 原理:利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积的
16、样品中微生物的数量。 方法:用计数板计数。 缺点:不能区分死菌与活菌。 (2)间接计数法(活菌计数法): 原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。 计算公式:每克样品中的菌落数=(C/V)M,其中,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数,V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL),M代表稀释倍数。 操作:设置重复组,增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确,一般选择菌落数在30300的平板进行计数。,考点二,考点一,考点四,考点三,典例4 (2014新课标全国卷)为了调查某河流的水质状况,某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量,并进行了细菌分离等工作。回答下列问题:
