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1、基因操作,第七章,Gene Manipulating,2019年3月15日8时25分,1,2019年3月15日8时25分,2,第七节,基因操作在医学发展中的意义,The Significance of Gene Manipulating in Medical Develapments,江黎明 2012年10月,基因操作技术在医学方面的价值主要包括：,（1） 疾病相关基因和疾病分子机制的分析家；,（5）高效率、低成本地生产用于疾病防治的生物 活性蛋白质、细胞、器官。,（2） 建立新的疾病诊断方法-基因诊断；,（4）纠正人类基因缺陷的方法-基因治疗；,（3）发展出新的法医学鉴定方法-法医学鉴定；,
2、2019年3月15日8时25分,3,2019年3月15日8时25分,4,一、疾病相关基因分析,要确认某一疾病的相关基因，就是利用不同的方法将各种基因确定到染色体的实际位置上，并分析基因的结构和疾病状态下基因的突变。,1911年Wilson将红绿色盲基因首次定位到X染色体上，开创了人类基因定位的先河。,1968年Donahue利用系谱分析将Duffy血型基因定位于1号染色体上，这是人类首次将基因定位于常染色体上。,2019年3月15日8时25分,5,20世纪80年代以前，可进行结构分析的疾病相关基因仅限于个别功能异常非常明确，基因表达产物纯化较易的遗传性疾病，尤其是血液系统疾病如镰刀状贫血、地中
3、海贫血等。,20世纪80年代中期以后，随着分子生物学技术的发展，尤其是重组DNA技术水平的提高和PCR技术的广泛应用，使疾病相关基因的鉴定与克隆工作得以迅速发展。,2019年3月15日8时25分,6,（一）功能性克隆(functional cloning),从对一种致病基因的功能理解出发，克隆该致病基因。实际上是利用纯化蛋白克隆致病基因。,获得纯化蛋白后的基因克隆方式有两种：,获取部分氨基酸序列，推导出mRNA序列，合成 寡核苷酸探针，筛选 cDNA 文库；从基因组文库 获取其基因组序列。,制备特异性抗体，筛选表达型cDNA文库。,只要能获得部分氨基酸序列就可以进行基因克隆。,2019年3月1
4、5日8时25分,7,根据mRNA表达差异来克隆疾病相关基因：,（1）削减杂交(subtractive hybridization),（2）差异显示（differential display）PCR,（3）基于PCR的削减杂交法,将正常与异常的同一组织的mRNA或cDNA文库进行杂交，筛选出表达有差异的克隆；,能很灵敏地扩增两个mRNA样品中有差异的片段，克隆后进行分析；,将前两种方法结合起来，克服了削减杂交灵敏度低，差异显示PCR假阳性高的缺点。,2019年3月15日8时25分,8,缺点：,大多数症状的生理、生化变化很复杂，对与之有关的蛋白质了解甚少，对其基因表达主要组织也知之不多。,不同组织
5、甚或至于同一组织的蛋白质与mRNA的“正常”差异很难与特异性差异区别。,功能性克隆技术成熟、方法直接、费用较低，迄今仍是克隆基因的首选策略。,优点：,2019年3月15日8时25分,9,（二）定位克隆（positional cloning）,从一种致病基因的染色体定位出发，逐步缩小范围，最后克隆该基因 。系统的定位克隆包含：,遗传学分析：,分子生物学分析：,包括交换分析和连锁不平衡分析以确定致病基因的染色体定位；,包括染色体异常（缺失、易位等）分析和基因文库的筛选与基因克隆。,2019年3月15日8时25分,10,杜氏肌营养不良(DMD) 致病基因的克隆：,首先，遗传学的家族连锁分析确定了致病
6、基因位于Xp21（性染色体X短臂第2区第1条带）。,将病人的Xp21 DNA与正常人的杂交，从而减掉了相同的基因序列，最后剩余的序列即为病人缺失的基因。,2019年3月15日8时25分,11,新的技术,非定位候选基因克隆策略 (position-independent candidate gene approaches)：,定位候选基因克隆策略 ( positional candidate gene approaches)：,直接根据分子病理学变化和基因组作图中各种基因产物功能的了解预测出候选致病基因。,一旦致病基因的染色体定位得以确认，可以利用因特网上的基因网站所提供的基因序列数据鉴定出候选
7、致病基因。,2019年3月15日8时25分,12,（三）基因结构和产物功能的分析,利用对于某基因结构和功能的理解，分析其与疾病的关系、是否有突变、突变产物的致病机制。,获得未知基因后可进一步进行下列工作：,1克隆和分析全长cDNA序列：根据cDNA序列推出该基因编码的蛋白质的氨基酸序列；,2克隆基因全序列：分析存在的内含子，启动子以及其调节位点，探讨基因表达调控方式；,3确定基因在的位置和拷贝数：染色体中定位多用原位杂交法，拷贝数可用Southern杂交法确定。,2019年3月15日8时25分,13,4基因表达谱分析：该基因在不同组织、细胞的表达状态。Northern blotting和点阵杂
8、交检测mRNA的水平。Western blotting检测蛋白质的表达。,5基因表达产物的功能分析：,（1）找已知功能的同源蛋白或同源结构域。,（2）在细胞内过量表达该基因，观察各种功能影响。,（3）在细胞内抑制该基因表达，分析细胞功能变化； 建立基因剔除小鼠，分析基因产物功能。,（4）分析与该基因产物相互作用分子，或者是相互 作用的蛋白分子或核酸。,2019年3月15日8时25分,14,二、制造生物活性蛋白,基因工程技术的发展在医学上最重要的成就表现在治疗用生物活性蛋白或疫苗的生产和使用。,通过基因的克隆，可获得具有特定生物学活性的蛋白质。这尤其适用于那些来源特别有限的蛋白质，或自然界本不存
9、在的蛋白质。,克隆基因的表达可在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳类细胞或整体动物体内。,2019年3月15日8时25分,15,生物安全性：,活性的可控性：,资源和生产成本：,未发现诸有如此类猪胰岛素、牛脑垂体提取的生长激素、人血VIII因子的副作用。,基因工程产品的可重复性要好于生物提取物。,无资源依赖性，生产成本也明显低于生物提取。,基因工程产品比生物提取产品有明显的优势：,表7-1 临床正在使用或试用的部分基因工程产品,2019年3月15日8时25分,16,2019年3月15日8时25分,17,（一）重组DNA技术,是在编码蛋白质基因的特定位置引入碱基替代、产生小的碱基缺失或插入，
10、使其编码的蛋白质的一级结构发生改变。,在合成PCR引物时，除了在定点诱变的位置引入相应的突变（点突变、小片段插入或缺失）外，其余序列与模板完全配对,PCR扩增后，产物中就引入特定的突变；将PCR产物克隆表达，可获得定点突变的蛋白质。,PCR诱变：,2019年3月15日8时25分,18,1.蛋白质工程中的定点诱变技术,表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的建立和表达产物的分离、纯化等技术和策略。,外源基因表达涉及目的基因的克隆、复制、转录、翻译、蛋白质产物的加工及分离纯化等过程，需要在适合的表达系统中完成。,表达系统可根据受体细胞的不同分为原核表达系统和真核表达系统。,2019年3月15日
11、8时25分,19,2.目的基因体外表达,真核表达载体大多是穿梭载体,含有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因和MCS等序列；,含有真核细胞的启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号和PolyA化信号及遗传选择标记等组件。,2019年3月15日8时25分,20,原核表达载体,含有强启动子及其两侧的调控序列，SD序列，带有转录终止序列,含有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因和MCS等序列；,（1）目的基因在原核系统中的表达,大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用,优点是培养方法简单、迅速、经济而又适合大规模生产。,2019年3月15日8时25分,21,在真核细胞中表达外源基因的体系主要有酵母、昆虫细胞
12、（杆状病毒）、哺乳动物和高等植物。,2019年3月15日8时25分,22,（2）目的基因在真核细胞中的表达,瞬时表达（不与宿主染色体整合 ） 常用的瞬时表达宿主是来源于非洲绿猴肾CV-1细胞的COS细胞。,稳定表达 （整合至宿主染色体中 ） 常用的稳定表达宿主细胞是来源于中国仓鼠卵巢的CHO细胞。,2019年3月15日8时25分,23,（二）转基因技术简介,转基因技术(transgenic technique),利用DNA重组技术在动物体内引入可遗传给子代的外源基因的技术。,转基因(transgene)： 被导入的目的基因,Microinjection into the Pronucleus
13、of a Bovine Zygote,转基因动物(transgenic animal)： 目的基因的受体动物,基本原理 采用基因转移技术将目的基因导入受精卵的细胞核内或着床前的胚胎干细胞，然后将细胞导入受体动物子宫，使之发育成个体。,2019年3月15日8时25分,24,基因的导入方式：,显微注射法(最常用) 胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法,2019年3月15日8时25分,25,显微注射是最早发展，也是最为有效的外源 基因导入方法。,将目的基因直接注射到受精卵内，目的基因即可与 受精卵的染色体整合，最终可产生带有外源基因的 转基因动物。,转基因动物发育后，在其体细胞和生殖细胞中都有 外源基因的
14、存在和表达，并可将该基因遗传给子代。,可以在携带外源基因的载体内加上组织特异性启动 子，从而在转基因动物体内限定表达外源基因的组 织和器官。,显微注射法建立转基因鼠技术路线,目的基因,供体动物,受精卵,受体动物 输卵管,动物 幼崽,转基因 动物,微注射,移植,妊娠 出生,分子 检测,2019年3月15日8时25分,26,1982年哈佛R.D.Palmiter“制造”的“超级小鼠”,其中有七只带有融合基因，六只生长迅速，每只体重平均可达44g，为同窝无融合基因小鼠平均体重29g的1.5倍。,把这种重组的质粒注射入小鼠受精卵中，经过充分发育后分娩出了21小鼠。,将大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白基
15、因的启动子顺序连接，再引入质粒中。,转基因小鼠,正常小鼠,2019年3月15日8时25分,27,2000年法国科学家“制造”出发出绿色荧光的兔子“Alba”。,改造水母的荧光蛋白基因使荧光蛋白发光率提高了2倍，再将该基因显微注射转入到兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。,在普通光线下它看上去与其它同类没有区别，但在较暗光线下它的身体就会放射出奇异的绿光。,2019年3月15日8时25分,28,乳腺生物反应器的诞生,据推测，2010年世界上采用动物乳腺生物反应器生产的年产超过了500亿美元。,1987年Gordon等将组织型纤溶酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清蛋白基因的启动子构成重组
16、基因，培育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠。,2019年3月15日8时25分,29,2019年3月15日8时25分,30,2019年3月15日8时25分,31,显微注射法等传统的转基因技术具有随机性和不可预见性、整合率、表达低等式缺陷。,外源基因的拷贝数和整合位点都是随机的；,小鼠,大鼠,兔,牛,猪,绵羊阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。,整合率极低，得到的转基因动物数量更少。,采用非受精卵还出现嵌合体；,受到宿主染色体上整合位点的影响，大部分转 基因表达水平较低。,2019年3月15日8时25分,32,即体细胞克隆技术，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。,2019年3月15日8时25分,33,核转移技术可使一个细胞变成一个个体，所产生的个体携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖过程，即克隆(clone)。,（三）核转移技术简介,2019年3月15日8时25分,34,1.动物克隆转移的核末经修饰,2019年3月15
