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1、 毕业论文加减三黄汤对感染耐药大肠杆菌鼠IL-2、IL-6 和NO的影响The Effects of IL-2, IL-6 and NO from mose effected Resistance E.coli by Modified Three Yellow Soups姓 名： 指导教师： 院 系：动物科技学院动物医学系专 业：动植物检疫年 级：2007级动植物检疫本科班论文提交时间：2011年6月9日目录引 言- 3 -1 材料与方法- 4 -1.1 材料- 4 -1.1.1 试验药品- 4 -1.1.2 试验菌株- 4 -1.1.3 仪器设备- 4 -1.1.4 试验动物- 4 -1.2
2、 方法- 4 -1.2.1 试验菌液的制备- 4 -1.2.2 抑制剂配方的制定及提取物的制备- 5 -1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定- 5 -1.2.4 中药抑制剂与耐药性大肠杆菌使用量的确立- 5 -1.2.5 分组与模型制作- 5 -1.2.6 相应测定体重变化胸腺、脾免疫器官指数- 5 -1.2.7 组织匀浆制备，血清及组织匀浆因子检测 NO试剂盒检测免疫力- 6 -1.2.8 统计结果，确定中药组方疗效- 7 -2 结果- 7 -2.1 中药抑制剂在机体中最佳使用剂量- 7 -2.2 耐药大肠杆菌最佳攻毒量- 7 -2.3 实验期间各组死亡情况与疗效结果- 7 -2.3.1
3、自然死亡情况- 7 -2.3.2疗效- 8 -2.4各组小鼠免疫器官指数的测定结果；- 8 -2.5 血清及组织细胞因子检测- 8 -2.5.1 NO对小鼠免疫功能的影响- 8 -2.5.2白介素2对鼠免疫功能的影响- 9 -2.5.3 白介素6对鼠免疫功能的影响- 9 -3讨论- 9 -3.1 讨论- 9 -3.1.1促进机体免疫器官的发育，提高机体免疫力- 9 -4结论- 10 -参考文献- 11 -致谢- 12 -加减三黄汤对感染耐药大肠杆菌鼠IL-2、IL-6和NO的影响范建超动物科技学院 07级动植物检疫专业本科班指导教师：尹秀玲中文摘要：目的：探讨加减三黄汤对多重耐药性大肠杆菌病的
4、影响。方法：确定加减三黄汤（2g/ml）对高度耐药的人源2952(O142+O26+O13)菌株的接种量以原液的0.5ml（2.4109CFU）。选取健康的30只小白鼠，随机分为健康组，阳性对照组和攻毒治疗组。自感染试验菌第1天起，试验组每只小鼠每天分别灌服中药制剂提取物0.5ml，连续7d。在感染后第8d，随机抽取测定生化指标，剖检测定免疫器官指数，血清及组织细胞因子IL-2、IL-6、NO含量。结果：加减三黄汤对人工感染耐药E.coli后可以显著提高血清及组织因子IL-2的含量，NO的含量影响肝脾的恢复。结论：加减三黄汤对,多重耐药性大肠杆菌能起到一定的耐药逆转作用，对动物机体具有一定的免
5、疫保护作用。关键词：耐药性大肠杆菌， IL-2，IL-6，NOThe Effects of IL-2, IL-6 and NO from mose effected Resistance E.coli by Modified Three Yellow SoupsFan Jianchao(animal and plant quarantine, College of Animal Science and Technology ) Guide Teacher: Yin Xiuling Abstract : Objective: The effect of Modified Three Yellow
6、 Soups(MTYS) by modified was investigated on multidrug resistant E.coli. Methods：the 2g/ml inoculum of multiple drug resistance to No. 10 E. coli was determined and inoculated by 0.5ml (2.4 109CFU) In vivo test. The 30 mouse were randomly arranged into 3 groups, the positive control and experiment g
7、roup were inoculated with the 0.5ml extractive of MTYS each day for seven days. After the eight days, some slikies fowl were randomly taken from each group for detecting blood serum biochemical indicator , immune organ index and the content of Serum and organization of cytokines IL - 2, IL-6 and NO,
8、. Results: MTYS had very obviously effect on varying degrees of increase in immunity. IL-2 levels and NO content were increase significantly of serum and tissue factor,then effect the recovery of the liver and spleen. Conclusions: MTYS had obviously inhibitory effect to resistant multidrug E.coli an
9、d immunoprotection on creature.Key words: the resistant E.coli isolated from mouse ; inhibitor; biochemical indicator; IL-2, IL-6 and NO引 言大肠杆菌是畜禽的重要致病菌，随着大肠杆菌耐药株的不断增多，大肠杆菌感染及其食品污染有不断上升的趋势，尤其是人类食物中毒和胃肠炎的不断暴发已成为全球关注的焦点，因此，控制耐药菌的传播和防治细菌感染己成为一个世界性难题。在细菌性疾病中大肠杆菌是兽医临床感染中的常见病原菌, 其病原抗原较复杂，在临床上表形症状和剖检病理变化也较
10、多，给养殖业带来了重大损失。自从1940年青霉素问世以来，很多抗生素在各种常见细菌性疾病的治疗中发挥了重要的作用。但随着抗生素的广泛应用，越来越多的病原菌产生了耐药性，而且耐药性严重。尤其大肠杆菌对青霉素类（青霉素耐药率为99.05%）、大环内酯类（红霉素耐菌率为79.72%）、氨基糖苷类（链霉素耐菌率为48.98%，庆大霉素耐菌率为43.88%）、诺酮类（氧氟沙星耐菌率为37.76%）耐药性都很高1-2。如果对大肠杆菌耐药性处理不好，发展成超级菌，那将对感染畜禽的治疗将带来很大的困难。目前对多重耐药性大肠杆菌抑制剂的研究已有很多报道，但对抗耐药性大肠杆菌中药抑制剂的研究报道较少。我国有着得天
11、独厚的中药资源，中药在治疗感染方面显示了独特的作用，同时中药具有资源丰富、作用靶位多、毒副作用较小、价格便宜及体内使用安全等优点。中草药的活性成分可抑制耐药性大肠杆菌主动外输系统，使耐药性大肠杆菌消除其耐药性3-4。本试验以耐药机制清楚、致病作用强的人源性大肠杆菌作为研究对象，利用以黄连、黄芩、黄柏清热解毒为主的中药三黄汤，佐以大黄清热兼能活血散瘀，共达清热解毒、活血散瘀的功效5。以芩柏龙胆散治疗大肠杆菌病模型鼠，结果该方剂可有效降低大肠杆菌病的死亡率，缓解其内脏病变的程度，保护病鼠的精神和食欲，加速康复过程，来消除其多重耐药6-7。据报道，中药的活性成分能够明显抑制耐药大肠杆菌的外输系统，对
12、R质粒具有明显的消除作用8。通过对传统中药三黄汤加减配成不同组方，观察体外抑菌效果，筛选出能够抑制大肠杆菌药物耐药性的抑制剂，来消除其多重耐药。通过探讨其对不同耐药程度的大肠杆菌的影响，选取有效药物进行合理组方，通过与抗生素联合增敏试验，确定最佳组方。然后对中药组方作用于感染大肠杆菌鼠前后血液生理生化指标检测，分析中药组方对机体的保护作用，从分子生物学角度研究药物对大肠杆菌的作用机制，本实验先通过在体外对人源大肠杆菌进行临床分离细菌鉴定、分离培养、血清型鉴定和耐药性检测，然后再将分离鉴定的菌株回归到动物体内，对小鼠的免疫力进行检测，获取有效组方应用于临床，可为该病今后防治提供一定依据。1 材料
13、与方法1.1 材料1.1.1 试验药品 黄连、厚朴、苦参、大青叶、穿心莲、黄芩、黄柏、木香、甘草、黄芪、茯苓、均购自张家口医药公司。营养肉汤 北京海淀区微生物培养基制品厂生产。麦糠凯琼脂 北京陆桥技术有限责任公司生产。1.1.2 试验菌株 经临床分离9生化鉴定的人源大肠杆菌进行血清型鉴定，获得致病性高度耐药的人源2952(O142+O26+O13)菌株。（北京天坛生物制品检定所鉴定，本室保存）。1.1.3 仪器设备 旋转蒸发器、LDZX-40B1型不锈钢立式自动电热蒸汽压力灭菌器、SZX-01型超静工作台、SKP-01型电热恒温培养箱、电子天平、微量加样器、爱林牌WZRX1微量吸液器 苏州市东
14、吴医用电子仪器厂，Cap-Ria 16 GAMMA COUNTER 美国产，FT-614混匀器 核工业部，北京和仪器厂，HH-W21-420BS电热很温水浴箱，上海跃进医用光学器械厂，541-10000-00-0 HEIDOLPH 振荡器 REAX top Glasblasreei-Krankenhausbedarf laboreinrichtungen. Hassa Laborbedarf 24 200 anthos fluido 洗板机，anthos labtec instruments 128c 酶标仪 Clinibio。1.1.4 试验动物 100只小白鼠 购自河北北方学院附属实验牧场
15、。1.1.5 试剂 碘125I白细胞介素-2放射免疫分析药盒说明书 北京普尔伟业生物科技有限公司 碘125I白细胞介素-6放射免疫分析药盒说明书 北京普尔伟业生物科技有限公司 血清因子IL-2、IL-6、NO试剂盒购自上海沪峰试剂有限公司。1.2 方法1.2.1 试验菌液的制备 将分离并筛选人源性大肠杆菌菌株10进行复苏培养18h24h。在无菌操条件下，吸取20ul菌液，接种于含2.0ml营养肉汤培养基试管中，按10-1、10-2、10-3、，十进位稀释，置37培养。每种菌株做两个重复。采用显微镜直接计数法进行活菌计数，配成约含菌量为109CFU/ml的菌悬液。1.2.2 抑制剂配方的制定及提取物的制备 根据传统中药理论和配伍原则及三黄汤配方进行加减，制成如下配方：中药制剂（MTYS）黄芩12g、黄连12g、黄柏12g、穿心莲9g、苦参9g、金银花15g、大青叶15g、木香6g、甘草9g、厚朴9g、黄芪9g、茯苓9g，水煎剂。1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）的
