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1、CIL病毒分离技术_乙肝病毒,北京京科肝泰医院,病毒性肝炎在我国各类传染病中发病率最高 HBV携带者最终死于相关肝病的危险性，男性为50%，女性为15%，与男性病人的病毒不易被清除及吸烟、饮酒等相关 中国的慢性乙肝病人中25%40%最终死于肝硬化或合并肝癌；,乙肝是一类大病，在我国感染人数有1到2亿，目前国内或者国外对于乙肝的治疗主要方法还是抗病毒保肝护肝的治疗。然而，患者的病情往往会反反复复，即使对于患者的病情控制的非常得当，也只能在一段时间内起到较好的效果。如何能够彻底的治愈，现在还没有很好的方案。,肝癌30-50万 肝硬化500万 慢性重型肝炎50-100万 慢性迁延性肝炎阶段1000万
2、 HBV携带者一亿九千万,传染源：主要为急、慢性乙肝患者或病毒携带者 传播途径：是通过血液传播，大多数情况通过注射；二是通过母婴传播；其次性传播。垂直传播是我国HBV感染的主要模式.,流行病学特征,2003年的一项调查表明随着社会发展、医疗技术条件的改进、人民生活方式的变迁，通过生活密切接触传播已越来越成为乙肝的主要传播方式 乙肝不会通过水和食物以及通常的接触传播的（不过不能合用剪刀，指甲钳，牙刷等）,乙肝病毒的传播,7,感染者年龄高峰：低发病区：2040岁 高发病区：48岁 男女感染率相近，但发病者男多于女 感染时年龄越小，越易形成慢性肝炎、肝硬化或慢性HBV携带状态（免疫耐受） 感染后对相
3、同HBsAg亚型的HBV再感染有持久免疫力，但对不同亚型的保护力不完全,易感人群,潜伏期：26个月 临床类型：婴幼儿期感染近90%转为慢性，成年人感染85%以上可痊愈，10%左右转为慢性 痊愈 痊愈 静止性肝硬化,乙肝临床特点,急性感染,慢性乙型肝炎,肝硬化,肝癌,死亡,慢性携带者,肝硬化,死亡,三部曲：肝硬化、慢性乙肝、肝癌,乙肝预后,慢性乙肝,肝硬化,肝癌,10%,10%,乙肝五项：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb HBV-DNA：血液中最先能被检验出来（感染一周内），但其检测比较昂贵,乙肝检测,HBV-DNA（）是病毒感染的直接证据 （）提示病毒复制水平低或已清
4、除,接种疫苗是最好的方法,13,乙肝预防,安全注射（包括针具），对牙科器械、内镜等医疗器具应严格消毒，严格防止医源性传播 服务行业中的理发、刮脸、修脚、穿刺和文身等用具也应严格消毒 注意个人卫生，不共用剃须刀和牙具等用品。进行正确的性教育，若性伴侣HBsAg阳性者应接种乙型肝炎疫苗 对HBsAg阳性的孕妇，应避免羊膜腔穿刺，并缩短分娩时间，保证胎盘的完整性，尽量减少新生儿暴露于母血的机会,传播途径预防,诊断急性或慢性乙型肝炎患者时，应按照中华人民共和国传染病防治法，及时向当地疾病预防控制中心（CDC）报告，并应注明是急性乙型肝炎或慢性乙型肝炎 建议对患者的家庭成员及其他密切接触者进行血清HBs
5、Ag、抗-HBc和抗-HBs检测，并对其中的易感者（该3种标志物均阴性者）接种乙型肝炎疫苗,对患者和携带者的管理,根据病情确定是否住院或在家治疗 患者用过的医疗器械及用具（如采血针、针灸针、手术器械、划痕针、探针、各种内镜及口腔科钻头等）应严格消毒 尤其应加强对带血污染物的消毒处理,乙肝患者的处理,不能献血及从事国家法律规定的特殊职业（如服兵役等） 可照常生活、学习和工作，要加强随访 传染性高低，主要取决于血液中HBV-DNA水平，与血清ALT、AST或胆红素水平无关,慢性HBV携带者及HBsAg携带者的处理,乙型肝炎病毒简称乙肝病毒，也称丹氏颗粒，颗粒分为外壳和核心两部分。它是一种DNA病毒
6、，属于嗜肝DNA病毒科，这是一种传染性很强的病毒，它可以通过血液、精液和其他体液进行传播。乙型肝炎病毒治疗主要以适当休息和合理营养为主，加上抗病毒药物治疗。,HBV病毒介绍,以肝脏为主要靶器官，对肝脏有亲嗜性，引起肝脏炎症的病毒。,感染乙肝病毒的病人血清中有三种不同形态的颗粒，分别为大球形颗粒(直径42nm)、小球形颗粒(直径22nm)和管形颗粒(直径22nm)。,大球形颗粒又称Dane颗粒，是1970年Dane首先用电镜在乙肝病人血清中发现的。Dane颗粒是有感染性的完整HBV颗粒，呈球形，具有双层衣壳。外衣壳由来自宿主的脂质双层和包膜蛋白组成，有大约400个HBV表面抗原（HBsAg）即蛋
7、白镶嵌于脂质双层中。用离子去垢剂处理病毒颗粒，去除病毒外衣壳后，暴露出内层核心。核心的表面为病毒的内衣壳，内衣壳蛋白为HBV核心抗原（HBcAg）。HBcAg经酶或去垢剂作用后可暴露出e抗原(HBeAg)。核心颗粒中间包裹着双链DNA分子、DNA聚合酶（P蛋白）等。,而小球形颗粒和由小球形颗粒串联而成的管形颗粒均由病毒的包膜蛋白构成，不含病毒基因组，因而不具有感染性，被称为亚病毒颗粒。,HBV 感染与复制过程 感染途径 乙型肝炎病毒无论通过哪个途径，乙肝病毒进入血液循环在体内流动，会经过人体的一个非特异性免疫清除，在血液循环里面要经过吞噬细胞的吞噬。病毒在循环中突破了这些屏障，游离到它需要复制
8、的靶位，即肝细胞。病毒进入肝细胞复制，首先要使肝细胞接受它，也就是说肝细胞上要有受体与病毒结合。病毒可以依靠肝细胞的细胞膜的某一部分，通过胞引作用进到肝细胞内。病毒可以在此释放核酸，核酸在肝细胞内依靠细胞内的原料进行复制和合成。,复制与免疫应答 病毒一旦在肝细胞内复制，肝细胞就会有核酸出现，核酸产生后核心抗原就会相应的出现。核心抗原会包裹核酸，但由于核酸分子较小，包裹以后会有多余的一部分结构。多余的部分可以被核内的一些酶切掉，这一部分就是 E 抗原。因此 E 抗原的存在就是乙肝病毒复制的一个标志。 E 抗原从肝细胞释放到细胞以外，血液循环里面就能够检测到 E 抗原的存在。人体的免疫细胞就会通过
9、免疫的应答产生相应的抗体，即 E 抗体。在病毒复制的初期， E 抗原产生的量要大于抗体，因此这时检测到的是 E 抗原而 E 抗体检测不到。,免疫损伤 人体除在血液循环内对抗原进行应答之外，含有病毒复制的肝细胞还会有细胞膜结构的一些变化。这些变化可以诱导人体的免疫细胞，对有病毒的肝细胞进行免疫应答，从而对该细胞进行杀伤，使肝细胞发生免疫损伤，细胞内的转氨酶就会释放到血液循环内，细胞核也会破碎从而把细胞内的物质释放出来，这就是免疫应答的过程，导致了免疫损伤。因此也导致了我们所说的肝功能损害，通过一些生化指标的监测可以监测到肝功的损害。,cccDNA 的形成 乙肝是慢性疾病，乙肝病毒在肝细胞内是连续
10、传代。病毒一旦进入肝细胞以后就会开始复制，复制出的病毒就会从肝细胞里面释放出来，而释放出来的病毒除了被人体免疫系统进行识别和杀伤之外，还有一部分会再侵犯其他的肝细胞，并在其他肝细胞里面再进行这样的复制，如此循环。能够在肝细胞里复制的病毒是有活性的，这种乙肝病毒它的 DNA 是松散的双链结构。它是个这种双链结构是松散的而不是闭合的环结构。但是，有些病毒的核酸在进到肝细胞的细胞核以后，在 DNA 聚合酶的作用下，将环形松散的缺口补齐，变成一个超螺旋的共价、闭合、环状 DNA ，即 cccDNA 。,HBV cccDNA：“睡眠”的病毒 DNA cccDNA 形成之后状态比较稳定，可以称其为肝细胞核
11、内“睡眠”的病毒 DNA ，当病毒活跃性复制时，它又可以作为一个模块来复制病毒。一般在每个肝细胞核内，可以有 550 拷贝的 cccDNA 。,cccDNA 的意义 cccDNA在肝细胞内很稳定，只要肝细胞不被破坏很少释放到外周血液循环，因此很难从血液中检测。但如有大片肝细胞坏死，大量的 cccDNA 就会从细胞核内释放到血液循环，此时人体的免疫系统除对释放的 cccDNA 有应答外，对于人的细胞核也会产生抗体，即抗核抗体。抗核抗体的存在是细胞核暴露所引起的。,是乙肝病毒的核心物质和病毒复制的基础。在病毒DNA携带的遗传基因发出的“指示”下，HBVDNA分别复制出新的病毒外壳和DNA核心，随后
12、重新组装，形成大量的新病毒，释放出来继续感染其他肝细胞。 乙肝病毒DNA是HBV感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标，HBV-DNA阳性，提示HBV复制和有传染性。HBV-DNA越高表示病毒复制越厉害，传染性强。中国以及亚太地区乙肝治疗专家均指出：乙肝病毒的持续复制是乙肝致病的根本原因，乙肝治疗的根本目的是抑制病毒复制。,乙肝病毒DNA(HBV-DNA）,病毒的繁殖被称之为“复制”，在复制的过程中，有两个很重要的因素：一个是催化剂，另一个是模板。没有这两个因素，乙肝病毒就不能复制。乙肝病毒复制的“催化剂”就是乙肝病毒DNA（即HBV-DNA）聚合酶。没有这种聚合酶的作用，乙肝病毒的复制就会停止
13、。,检测乙肝病毒DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”，它主要是用来判断人体内存在乙肝病毒的多少和传染程度的。如果检测值大于1000或者5.0e+ 002拷贝/ML。说明乙肝病毒DNA呈阳性，提示HBV复制和有传染性。HBV-DNA越高表示病毒复制越厉害，传染性强。这对于乙肝治疗过程中的监测，治疗效果的判断，治疗方案的制定都有着重要的意义。,乙肝病毒的基因组（HBV-DNA）是由两条螺旋的DNA链围成的一个环形结构。其中一条较长负链已经形成完整的环状；另一条长度较短的正链，呈半环状。在感染肝细胞之后，这条半环状的DNA链就会以负链为模板，在催化剂HBV-DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整
14、的环状。这时的乙肝病毒基因组就形成了一个完全环状的双股DNA。把这种DNA称做共价闭合环状DNA（即cccDNA），可以把它看作是病毒复制的原始模板。模板形成后，病毒基因会以其中的一条cccDNA为模板，利用肝细胞基因中的酶和DNA聚合酶的“催化”，一段基因又一段基因地复制，形成负链和正链。最后再装配到一起形成新的HBV-DNA颗粒。,复制的第一步：黏附 HBV人侵人体后，依靠其外膜(表面抗原，HBsAg)能粘附在肝细胞膜上，当然，粘附的首要条件是HBsAg先要识别肝细胞膜。一旦粘附成功，HBv的外膜也就完成了它的使命，甩掉了外膜，HBV钻进肝细胞内。,复制的第二步:脱壳 HBV核心部分来到肝
15、细胞内，在肝细胞浆中还要脱掉它的“核壳”(核心抗原即HBcAG及E抗原即HbEAG)，这样，就暴露出了它最核心部分，即乙肝病毒核酸(HBvDNA)，HBV大有“赤膊上阵”之意。HBVDNA包涵着乙肝病毒的全部基因，是它主宰着HBv的复制的。,复制的第三步：入核 HBvDNA从肝细胞浆内进入肝细胞核，在这里它要进一步发育完善，形成了HBv的“共价闭合环状脱氧核塘核酸”(HBvcccDNA)。这个cccDNA十分了得，它深深藏匿在肝细胞核内，而肝细胞核外面有一层坚韧的核膜。目前药物都难以通过这坚韧的核膜，因而对cccDNA也无可奈何，但cccDNA却掌控着HBv所有的遗传信息，指令着HBv的复制。
16、因此现有的药物想彻底消灭人体内的HBv真比登天还难，这些药物只能抑制HBv的繁殖或复制，“全部转阴”也只能是一种幻想。,复制的第四步：转录 HBV在这一阶段会以cccDNA为“模子”，像录音带似的把HBvcccDNA上的所有信息全都转录到“信息核糖核酸”(mRNA)上。这个转录过程需要人体内的酶类帮忙，因为所有的病毒都不能自己独立生活必须有生物的机体帮忙，才能完成这个转录过程。HBv也是这样。在人体酶类的帮助下完成它的复制环节。,复制的第五步：翻译 在mRNA上已录取了HBv的所有信息，然后就是“翻译”了，其实就是开始制造病毒蛋白。MRNA通过“翻译”过程，可将HBv的各种蛋白制造出来，如HBv的外膜蛋白(HBsAg)、核壳蛋白(HBeAg、HBcAg)、HBvDNA多聚酶等；至此，HBv的外膜有了，HBv的核壳也有了，这些东西只是零件，飘浮游离着的，还有重要的HBv最核心部分没有“制造”山来。,复制的第六步：逆转录 “逆转录”:把HBv的遗传信息从DNA转录到RNA上叫做“转录”，是正常的“顺转录”；而将
