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1、第四章 药物定量分析 与分析方法验证,廖琼峰,,第四章 药物定量分析与 分析方法验证,第一节 定量分析方法特点,第二节 药品质量标准分析方法验证,第三节 生物样品分析方法的基本要求,第一节 定量分析方法特点,重量分析法 容量分析法 光谱分析法 色谱分析法,一、重量分析法,生成的沉淀而进行分析的方法,生成沉淀滤过洗涤灼烧恒重。,特点： 1、操作繁琐 2、结果准确,很少用,第一节 定量分析方法特点,二、容量分析法,为经典方法，原料药分析常采用。,指示剂和灵敏度是影响结果的原因之一,常产生滴定误差；,特点： 1、快速,准确（RSD0.2）,灵敏度高； 2、适合于中、高含量组分分析（1%）； 3、仪器
2、简单，操作方便，适用范围广；,第一节 定量分析方法特点,滴定度：指每1ml某摩尔的滴定液所相当的被测药物的重量。CHP用mg来表示。 aA(待测物）bB（滴定液）cCdD Tm(a/b)*M（mg/ml） 百分含量计算：直接滴定法和回滴定法,第一节 定量分析方法特点,1、直接滴定法：,含量（）（VTF）W100,2、回滴定法：即剩余滴定法,先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应；待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A,第一节 定量分析方法特点,2、回滴定法：即剩余滴定法,做空白试验的含量计算：,含量(V0-VB)*T*F/W100,F：浓度校正因子=实际浓度/标准
3、浓度,第一节 定量分析方法特点,三、光谱分析法,UV、IR、MS、NMR和荧光分析,1、紫外可见分光光度法,计算分光光度法可测定多组分制剂的含量，现已基本不用。,灵敏度和准确度高，价格低、适用范围广,一般适用于纯组分的分析，如原料药或 单组分制剂（无辅料干扰）。,第一节 定量分析方法特点,灵敏度高（pg），低浓度，但适用范围有限，应用衍生化方法较多，在生物大分子分析中应用较多。,2、荧光分析法,第一节 定量分析方法特点,HPLC 适用范围广，越来越广泛 GC 使用有限制 TLC很少用于定量，多用于定性。,四、色谱分析法,第一节 定量分析方法特点,对内标物要求： a内标物须为原样品中不含组分 b
4、内标物与待测物保留时间应接近且R1.5 c内标物为高纯度物质，或含量已知物质,内标法：,内标法优点： 进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响 只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 适合测定微量组分 内标法缺点： 制样要求高；找合适内标物困难；已知校正因子,与进样量无关,四、色谱分析法,1、系统适用性试验： 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应达到规定的要求应符合要求。通常包括理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子。,2、定量方法：面积归一化法，内标法、标准曲线法、外标法等。,第一节 定量分析方法特点,（1）条件选择范围宽：包括色
5、谱柱、流动相、 检测器等。 （2）应用范围宽：以HPLC为最广泛。 （3）灵敏度高，准确度好，重现性好。 （4）操作繁琐，实验消耗大。 （5）多组分的分离分析，与光谱等联用，可进 行定性和定量分析。,3、色谱法特点：,第一节 定量分析方法特点,第二节 药品质量标准 分析方法验证,一、目的,证明所用的分析方法适合于相应的检测要求。,二、用途,1、药品质量标准起草时，,2、药物生产工艺方法变更、制剂组成改变、 对原分析方法进行修订。,方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。,验证分析项目,1. 鉴别试验； 2. 杂质定量或限度检查； 3. 有效成分含量测定； 4. 制剂中其它成分(降
6、解产物、防腐剂等) 的测定； 5. 溶出度、释放度等功能检查中，溶出量 的测定方法。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,验证内容,1 专属性 2 检测限 3 定量限 4 精密度 5 线性及其范围 6 准确度 7 耐用性,第二节 药品质量标准 分析方法验证,一、专属性（specificity）,1、定义：指在其他成分（杂质和制剂辅料等）可能存在下,采用的方法能准确测出被测物的能力。,2、意义：分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰程度的一种方法。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定 (6) 阴性对照溶液制备 按处方比例称取除西洋参以外的其余药味，按
7、制备工艺制成缺西洋参的阴性样品；按“供试品溶液制备”项下方法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，精密吸取20 L进样，观察样品峰的保留时间处是否有杂质峰。测得结果表明：样品峰保留时间处无杂质峰干扰（见附图2-1）。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,图2-1 定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定HPLC色谱图 1- 人参皂苷Re 2- 人参皂苷Rb1,A- 对照品,B- 样 品,C- 阴 性,二、检测限 (limit of detection, LOD),1、定义：试样中被测物能被测出的最低浓度 或量。,2、意义：LOD 是一种限度检验的效能指标,它反映方法与仪器的灵敏度和噪音大小，也表
8、明样品经处理后空白值的高低。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、测定法：,用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,（1）非仪器分析目视法,（2）仪器分析,一般以信噪比(S/N= 3或2)时的相应浓度或注入仪器的量确定为检测限。,4、数据要求,附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,三、定量限（1imit of quantitation，LOQ）,1、定义：样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。,2、测定法： （1）以信噪比（S/N）为10时相应的注入仪器的药物浓度或量进行确定。,（2）以仪器所测空白背景响应
9、标准差(SD)的10倍为估计值，再经试验确定。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,1、定义：在规定的测试条件下,同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度。,四、精密度,2、表示方法： 偏差（d）： 标准偏差(SD): 相对标准偏差(RSD):,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、表达形式：,（1）重复性：相同条件下，同一个分析人员测 定所得结果的精密度；,测定法：, 至少用9次测定结果评价：制备三个不同浓度样品，每一浓度样品测三次。, 把被测物浓度当作100%，至少测6次进 行评价。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、表达形式：,（2） 中间精密度 同一实验室，不同时间由不同分
10、析人员用不同设备所得结果的精密度。,目的：,日期、分析人员、设备,考察随机变动因素的影响,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（3）重现性 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。,3、表达形式：,当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定 (7) 方法重复性试验 取同一批号定坤胶囊样品6份(20041025),按“供试品溶液制备”项下方法操作，平行制备6份样品，在上述色谱条件下进行分析，测定，按人参皂苷Rb1的含量计算：RSD = 1.8 %(n=6)。,
11、第二节 药品质量标准 分析方法验证,五、线性及其范围, 线性：在设计的范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关系的程度。,1、定义：, 范围：达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、要求：线性范围要涵盖待测物的所有浓度 范围。,4、数据要求：应列出回归方程、相关系数 和线性图。,2、测定法：设计具有一定梯度的58个浓度点，用作图法或计算回归方程建立. Y=ax+b 0.999(相关系数）,第二节 药品质量标准 分析方法验证,五、线性及其范围,(3) 标准曲线绘制 取人参皂苷Rb1对照品10 mg，精密称定，置100 mL量
12、瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为103.0 gmL-1的对照品储备液。依次精密量取对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成人参皂苷Rb1系列标准溶液。分别精密吸取20 L，按上述色谱条件下测定。以对照品浓度X(gmL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得回归方程： 回归方程为：Y = 2.146103 X + 2.236103（ = 0.9998，n = 6） 结果表明人参皂苷Rb1在10.3-103.0 gmL-1浓度范围内，Y与X之间具有良好线性关系。,例：定坤丸中人参皂苷Re和
13、人参皂苷Rb1测定,六、准确度,1、定义：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。,2、测定法：用百分回收率（R）表示，测定回 收率的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（1）回收试验法 空白B+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,考察辅料对回收率是否有影响。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（2）加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,R =,测得量-本底量,加入量,100%,第二节 药品质量标准 分析方法验证,(8) 回收率试验 采用加样回收法，称取已知含量的同一
14、批号定坤胶囊样品9份（20041025），每份0.2 g，精密称定。按低、中、高浓度分别精密加入人参皂苷Rb1对照品溶液，每一浓度3份，按“供试品溶液制备”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定。测得方法平均回收率为99.7 %（RSD = 1.7%，n = 9），数据见Tab. 4-1。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定,Tab. 4-1 Recovery of ginsenoside Rb1 in Dingkun capsule,3、数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品，每一浓度测定三次。,RSD2%,（
15、1）原料药、制剂 UV、 HPLC：R= 98102% 容量法：R = 99.7100.3% （2）中药及其制剂,95105%,90110%,RSD5%,RSD3%,第二节 药品质量标准 分析方法验证,4. 判断含量测定方法准确度的方法,（1）回收率试验,（2）与已建立准确度的另一方法测定的结果 进行比较。,“回收试验法”和“加样回收试验法”,第二节 药品质量标准 分析方法验证,1、定义：指测定条件稍有变动时，结果不受 影响的承受程度。,七、 耐用性,2、意义：为常规检验提供依据，是衡量实验 室和工作人员之间在正常情况下实 验结果重现性的尺度。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,效能指标的选择,非定量分析,定量分析,微定量分析,一、常用样品的种类、采集和贮藏 二、生物样品分析前处理技术 三、定量分析方法验证,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,一、生物样品的种类、采集、制备和贮藏,（一）种类：,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（二）生物样品的采集和制备,1、血液（blood）血浆、血清和全血,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,体现药物浓度和治疗作用之间的关系。 最常用的生物样本。,（1）血样的采集： 注射器 、毛细管眼眶采血、静脉插管手术、 滞留针股静脉取血,动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。,（2）血样的
