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1、粪便中空肠弯曲菌检测 孙燕萍,一、空肠弯曲菌的分类和特性:,属于弯曲菌属。 主要包括空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、结肠(或大肠)弯曲菌(Campylobacter coli)、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)、乌普色拉弯曲菌(Campylobacter upsalensis)、胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)等11种。 其中空肠弯曲菌(C. jejuni)对食品安全的威胁最为严重。,空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是从20世纪80年代起受到国内外广泛重视的人畜共患病菌。 致病性: 人类:急性细菌性肠炎、格林-
2、巴利综合征 (GBS)、食物中毒。 动物:雏鸡腹泻与肝炎;火鸡的肝炎与蓝冠病。 犊牛的腹泻;绵羊的腹泻或流产。,空肠弯曲菌的生物学特性,革兰氏染色阴性。呈弧形,S形或螺旋形; 菌体两端尖,有极鞭毛,能做 快速直线或螺旋体状运动; 1.55m0.20.5m, 无荚膜。 微需氧环境:5% O2、10%CO2和85%N2。 最适生长温度:42-43,37 可生长,30 以下不生长。,空肠弯曲杆菌的流行病学和临床表现,宿主: 家禽、野生鸟类为最主要的传染源。 (Rosef 等在1981年调查了129个野生鸟类,结果 表明24.8%携带空肠弯曲菌) 鸟类迁移会造成病原菌对湖水与河水的污染。,细菌分布范围
3、 * 该菌分布广泛,已从多种动物中分离出;也发现于食物与饮水中,尤其是畜禽肉及脏器与鲜奶。 * 食用动物中鸡的带菌率为首位,其次为猪。主要分布在活鸡的消化系统中如腺胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、泄殖腔等。 * 该菌在人或动物的粪便中存活约4周;在被污染的水源中可存活约5周。,感染途径: * 传播途径主要是由于摄取了该菌污染的食物与 饮水后,细菌在人肠道内大量生长繁 殖,引起 急性肠炎。 * 被污染的禽肉与未经过巴氏消毒的牛奶是导致 发病的主要原因.,患者临床表现: 患者表现为发热、腹泻、呕吐或肌肉痛。潜伏期平均3-5天,病程约7-10天,粪便的特征是有时带血,镜检中有多形核白血球,重症
4、病例也有痢疾样血、粘液粪便。,根据美国疾病控制与预防中心(USA-CDC)多年的美国食源性病原微生物引起发病人数的统计资料,空肠弯曲菌导致的病例数排名第二。禽肉、生牛奶中的空肠弯曲菌被美国列为重点监测食源性致病菌之一。 32nd CCFH(1999年)提出5组优先评估的“病原-食品”组合,其中包括“禽肉-空肠弯曲菌”。 空肠弯曲菌在许多发达国家也是被报告最普遍的胃肠炎致病菌之一,如:美国、英国、丹麦、芬兰、爱尔兰、荷兰、挪威、瑞典、瑞士等。,NCTC 11168 基因组图谱,基因组相对小,大小在1.6-1.7Mbp. DNA中富含A/T,G/C比率在29-47mol%.由于基因组体积小,对培养
5、要求就比较苛刻。NCTC11168共有碱基对1.641.481个,含有1654个基因组。A/T的含量在69%。,二、粪便中空肠弯曲菌的检验技术 2012年试行 江苏省感染性腹泻综合监测工作方案,空肠弯曲菌,空肠弯曲菌: 在微需氧条件下42生长而25不能生长,在选择性固体培养基上形成特征性菌落,按照本标准检验时具有相符合的运动特性、生长特性与生化特性的革兰氏阴性菌。,设备和材料,微需氧培养装置: 能够提供微需氧条件(5% O2、10% CO2和85% N2) 如使用产气剂的 厌氧罐/袋或其它 可代用的装置等。,三气培养箱(如Binder等 ),弯曲菌检验程序,增菌液接种,方法一:稀释处理 将24
6、 h和48h的增菌液原液分别划线接种mCCDA平板. (备注:也可选用CFA显色平板或SimPlate分离鉴定及定量培养基) 优点:经济、方便 缺点:可能会有杂菌干扰,mCCDA平板上所挑取的可疑菌落通常带有金属光泽、扁平、湿润、沿划线生长。,CFA显色平板上所挑取的可疑菌落为红色、突起、湿润,菌落较小直径约23mm,边缘有一圈红色的透明环,中间有一个圆形的不透明、颜色较深的红色小点的菌落。,将所挑取的35个可疑菌接种到不含抗生素的 哥伦比亚血琼脂平板,微需氧条件下420.5培养24 h-48h后,进行后续的空肠弯曲菌鉴定。,空肠弯曲菌的鉴定,快速鉴定 1. 形态与动力性检测 * 对挑取菌落进
7、行革兰氏染色镜检,空肠弯曲菌为革兰氏阴性,弯曲如小逗点状,两菌体的末端相接时,呈S形、海鸥展翅状或螺旋状。 * 对挑取可疑菌落制作湿片,镜检可见本菌呈螺旋样运动。,快速鉴定,2 .氧化酶试验 使用铂/铱接种环或玻璃棒,挑取单个菌落的一部分,然后接种到用氧化酶试剂润湿的滤纸上,如果在10秒内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性,弯曲菌则为阳性。,快速鉴定,3. 过氧化氢酶检测 挑取一环菌落培养物,加到在干净显微镜玻片上的一滴3过氧化氢溶液中,如果在30秒内出现气泡则判定结果为阳性。,快速鉴定,4. 马尿酸盐水解试验 挑取欲检测的菌落培养物,加到盛有0.4mL 1的马尿酸钠的试管中制成菌悬液,注意不要
8、带入培养基琼脂。混合均匀后在37水浴中温育2 h或36培养箱中温育4 h。轻轻地在马尿酸盐溶液的顶部加入0.2mL茚三酮溶液,不要振荡,在37水浴或36培养箱中温育10 min后判读结果。若出现黑紫色则为阳性;若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。,快速鉴定,5. 吲哚乙酸脂水解试验 挑取欲检测的菌落培养物,加到羟基吲哚醋酸盐纸片上面,再滴加一滴灭菌蒸馏水。如果吲哚乙酸脂水解,则在510min内出现深蓝色;若没有颜色变化则表示水解反应没有发生。,后续鉴定 1. 微需氧条件下25生长试验 2. 有氧条件下420.5生长试验 3. 先锋霉素(头孢霉素)的敏感性检测 (可选) ISO :奈啶酮酸的敏感
9、性检测 (越来越多的C.jejuni与C.coli的非特异 性菌株出现),后续鉴定,微需氧条件下25生长试验 挑取欲检测的菌落培养物,接种到哥伦比亚血琼脂平板上,25微需氧条件下培养484h,若为空肠弯曲菌则不出现生长。,后续鉴定,有氧条件下420.5生长试验 挑取欲检测的菌落培养物,接种到哥伦比亚血琼脂平板上,420.5有氧条件下培养484 h,若为空肠弯曲菌则不出现生长。,后续鉴定,先锋霉素(头孢霉素)的敏感性检测(可选) 挑取菌落培养物,在布氏肉汤中制备成浓度为0.5 McFarland的菌悬液,再用布氏肉汤制备1:10的稀释液,在5Mueller Hinton血琼脂平板上进行涂布,静置
10、5min后去除多余液体,将平板在36培养箱中放置10 min。将先锋霉素(头孢霉素)药敏纸片放在琼脂表面。培养皿盖子在上面,36微需氧条件下将平板培养222h。如果细菌紧贴着纸片生长则为有抗性;如果纸片周围出现不同程度的细菌抑制生长则为敏感,主要弯曲菌的生化特性与鉴定表: 空肠弯曲菌 结肠弯曲菌 海鸥弯曲菌 乌普萨拉弯曲菌. 形态、动力性: 革兰氏阴性,弯曲如小逗点状,两菌体的末端相接时呈S形或 螺 旋状或海鸥展翅状,并呈现螺旋样运动 氧化酶试验: 阳 性 过氧化氢酶试验: 或微弱 马尿酸盐水解试验: 吲哚乙酸脂水解试验: 先锋霉素敏感性: R R R S 微需氧条件25生长试验: 不生长 有
11、氧条件42生长试验: 不生长 (注: 阳性; 阴性; S 敏感; R 有抗性),已试用过的弯曲菌生化鉴定与筛选检测的商品化试剂,C.1 弯曲菌的生化鉴定系统 C.1.1 API为手工生化鉴定系统,用于弯曲菌的菌种鉴定,鉴定结果准确,所需时间1天 。(需要一定的技术与经验积累) C.1.2 VITEK 2 为自动生化鉴定系统,可以鉴定出空肠弯曲菌空肠亚种、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌胎儿亚种,且结果准确,操作简便,所需时间6小时左右。,微生物API鉴定系统,C.2 弯曲菌的筛选检测方法 C.2.1 miniVidas用于弯曲菌的初筛,原理为酶联荧光免疫分析(ELFA)方法。对于结果阴性的可以直接判定为
12、阴性,对于结果阳性的需进一步确认,可比传统方法快2天。(具体参照厂家说明) C.2.2 BAX系统原理为利用PCR进行基因检测,用于空肠弯曲菌和大肠弯曲菌的筛选,阳性结果仍需确认。,空肠弯曲菌检测流程,样本制备,增菌,检测,样本 + 选择性增菌 肉汤,微需氧培养,阴性结果 无空肠弯曲菌,初筛方法检测,选择性平板进行分纯培养,阳性结果,经典培养鉴定方法,微生物手工/自动 生化鉴定系统,基因鉴定方法,谢谢大家!,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营:网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户,做到让客户满意!,致力于数据挖掘,合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面,打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,