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1、实验二,毛细血管采血、微量吸管及改良牛鲍计数板使用及显微镜法红细胞计数 医学检验技术教研室 13级检验用,一、毛细血管采血法,目的：掌握毛细血管采血方法。 实验器材：专用“采血针”、微量定量吸管、标本容器等。 标本：末梢血。,操作方法,首先用手指按摩采血部位，使中指或无名指指尖自然充血，再用75%酒精棉球消毒皮肤，待酒精挥发干燥后，用左手拇指和食指固定采血部位，右手持消毒刺针，自指尖腹侧迅速刺入2 mm3 mm，让血液自然流出，用消毒棉球擦去第一滴血后，按需要依次采血，采血完毕，用消毒干棉球压住伤口片刻即可。,注意事项,所选择的采血部位，不能有冻疮、紫绀、水肿、炎症等；皮肤消毒后，一定要乙醇挥
2、发干燥后采血，否则流出的血会四处扩散而不成滴；为避免交叉感染，采血针在使用前应进行高压灭菌，并严格实行一人一针制；如穿刺后血液不易流出，可于伤口远端稍加压力，或重新穿刺。切忌用力挤压，以免混入大量组织液，使血液稀释影响检验结果，且血液更易凝固；进行多项检查时，采取标本的顺序为血小板计数、红细胞计数、血红蛋白测定、白细胞计数等；出血时间测定需另外刺一部位，凝血时间另行测定。,二、微量吸管使用,1、目的：掌握微量吸管的实验方法。 2、原理：挤压乳胶头使微量吸管产生负压而吸取液体。 3、实验用品： 一次性微量吸管、带孔乳胶吸头、试管、2ml吸管、NS等。 4、标本：新鲜抗凝血,5、操作方法,（1）准
3、备吸管 将带孔的乳胶吸头套在微量吸管上，连接处应严密不漏气。 （2）加稀释液 取试管1支，加生理盐水2ml. （3）持管吸血 右手拇指和中指夹住吸管及吸头交接处，示指盖住吸头小孔，三个指头轻微用力，排出适量的气体使管内形成较小的负压，将管尖插入抗凝血（或末梢血），三个指头慢慢松劲，吸取抗凝血到所需刻度后，抬起示指，注意管尖始终不要离开液面，以免吸入气泡，也不要过度用力将血液吸入乳胶吸头。,（ 4）拭净余血 用干棉球顺微量吸管口拭净余血。 （5）稀释血液 将微量吸管插入含生理盐水（或稀释液）的试管底部，慢慢排出吸管内的血液，再用上清液冲洗管内余血2-3次。 （6）洗涤吸管 依次用蒸馏水洗净，95
4、%乙醇脱水。乙醚干燥。如为一次性微量吸管，可省略该步骤。,6、注意事项,（1）操作步骤3需反复练习才能准确吸取血液到所需量。 （2）一次吸取血液到所需的量，吸管内不能有空节也不能吸取血液过多，最好不要超过所需刻度的2mm. （3）稀释血液前一定要拭净管外余血，释放血液时的动作不能太剧烈，避免破坏血液成分或不能利用上清液将管内血液洗净。,7、实验评价,微量吸管使用是手工法血细胞分析的第一步，有很多因素影响检验结果的准确性和精确度，如一次性吸管的质量、操作者的技术熟练程度和责任心等。,三、改良牛鲍计数板的使用,（一）目的：掌握改良牛鲍计数板结构及使用方法。 （二）原理：一定倍数稀释的血液或体液混匀
5、后滴入具有固定体积和精密划分刻度的改良牛鲍计数板中，在显微镜下对所选择的区域中的细胞进行计数，在乘以稀释倍数，即可换算成单位体积内的细胞数。,（三）、实验用品,1、器材 改良牛鲍计数板、专用盖玻片、光学显微镜、绸布、微量吸管、带孔乳胶吸头、刻度吸管、试管。 2、试剂 红细胞稀释液 （四）标本：抗凝血,（五）操作,1、稀释血液 取试管1支，加红细胞稀释液2ml,加抗凝血10微升，立即混匀，制成红细胞悬液。 2、准备计数板 用绸布拭净改良牛鲍计数板和专业盖玻片，采用推式法从计数板下缘向前平推盖玻片，将其盖在计数池上。 3、冲池 用完了吸管吸取制备好的再次混匀的红细胞悬液，沿盖玻片与计数板之间的缝隙
6、冲入计数池。充液量以恰好充满一侧计数池为宜，不可过多、过少或有气泡，否则需重新操作。,附：牛鲍计数板基本结构,血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边
7、长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。,四、显微镜法红细胞计数,原理,用等渗稀释液将血液稀释一定的倍数后，滴入计数板，在显微镜下计数一定范围内红细胞数，经换算可求得每升血液中的红细胞数。,红细胞稀释液,Hayem液（赫姆氏红细胞稀释液 ） 枸橼酸钠稀释液 普通生理盐水或加1%甲醛的生理盐水,Hayem液,主要成分及作用： NaCl 调节渗透压； Na2SO4 调节渗透压，提高比重防止细胞粘连； HgCl2 防腐； 缺点：遇高球蛋白血症患者，由于蛋
8、白质沉淀而使红细胞易凝集。,枸橼酸钠稀释液,主要成分及作用： NaCl 调节渗透压； 枸橼酸钠 调节渗透压，抗凝； 甲醛 防腐； 优点：配制简单，可使红细胞在稀释后较长时间保持正常形态并且不凝集，故应用较广。,普通生理盐水或加1%甲醛的生理盐水,急时用。,【操作方法】,l、取红细胞稀释液1.99ml毫升，放入一小试管内。 2、用微量吸管吸血至l0ul处。 3、擦去管尖外部余血将血液迅速轻轻吹入盛有红细胞稀释液的试管内，吸上清液嗽洗吸管2-3次，立即摇匀。,4、用微量吸管或玻棒取混悬液少量，充入计数池内。 5、待23分钟，让红细胞完全下沉后，将计数板平放在显微镜台上，用低倍镜观察，如红细胞分布均
9、匀即可换高倍镜进行计数。,红细胞计数的区域: 中心大方格中的5个中方格(正中一个和四角各一个)。,充液位置,充液位置,为红细胞计数区域,计数原则: 数上不数下，数左不数右的计数原则 即凡压在中方格边线(双线)上的红细胞，只计上侧与左侧线上的细胞，而压在下侧与右侧线上者不计入。,压线细胞的计数原则：,数左不数右，数上不数下,【计算】 红细胞数/L=5个中方格内红细胞数510200106 /L=5个中方格内红细胞数1010 /L =5个中方格内RBC数/1001012 式中: 5: 5个中方格换算成1个大方格 10: 1个大方格容积为0.1ul，换算成 1.0 uL。 200： 血液的稀释倍数 1
10、06 : 由1uI换算成1L,例：红细胞稀释液1.99ml，加血10ul， 混匀。充液，静置23min，计数中央大 方格内四角和正中五个中方格内的红细 胞，共600个，请计算红细胞计数结果。,RBC/L600 / 525,10,200,106,6.01012,报告方式：,RBC: X.XX l012/L,七. 参考值,男性： (4.05.5)1012L 女性： (3.55.0)1012L 新生儿：(6.07.0)1012L,400550 万/ul,350500 万/ul,手工显微镜法红细胞计数,( RBC ),【注意事项】 1、吸管、试管要注意清洁、干燥以防溶血，操作迅速避免血液凝固，如有血凝块应重新采血。 同时做血红蛋白测定，白细胞计数和分类计数，在采血时应先做血膜再做红细胞，然后做白细胞，血红蛋白检验，避免红细胞破坏。,2、充液： 充液前，红细胞复液要充分摇匀，红细胞悬液注入计数池内要求分布均匀，不可有气泡，亦不可有多余液体外溢。,3、质量控制： 中方格内红细胞分布应均匀，健康成人每中方格红细胞数约为80100个，各中方格内之红细胞相近，如悬殊过大(超过10个细胞以上的)应重混匀再充填。,1.Hayem红细胞稀释液由哪些成分组成？ 各有什么作用？ 2.请说出红细胞计数的参考值。,复习思考题,THANKS,黔 东 南 民 族 职 业 技 术 学 院,
