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1、第四章 中药制剂的含量测定,内蒙古医学院 药物分析教研室,教学基本要求 掌握中药制剂含量测定中样品处理的方法 掌握可见-紫外光谱法的基本原理；熟悉运用双波长测定法、三波长测定法、差示光谱法进行中药成分定性、定量的原理和方法，了解导数光谱法的原理和操作。,掌握薄层色谱法的基本原理，定性、定量方法；掌握高效液相色谱法的基本原理，定性、定量方法；掌握各类高效液相色谱法分离条件的选择；了解高效液相色谱仪的组成及应用；了解液相色谱的新进展。,掌握气相色谱法的基本原理，定性、定量方法； 熟悉气相色谱分离条件的选择；了解气相色谱仪的工作原理，了解检测器的类型。 熟悉荧光分析法的基本原理及定性、定量方法；了解
2、库仑电量法、离子选择电极、原子吸收光谱及冷原子技术。,中药制剂的含量测定是质量控制的一项中药指标。 含量测定是研究某种成分的含量高低是否符合规定来判断药物的优劣。 含量测定已成为质量标准控制中必不可少的一个项目。,第一节 含量测定样品的处理,作用,1.将被测成分从样品中释放出来 2.除去杂质，纯化样品 3.富集浓缩或进行衍生化 4.使试样的形式及所用溶剂符合分析测定的要求,一、样品的粉碎 目的： 一是保证含量测定所取样品均匀而又代表性提高测定结果的准确度和精密度 二是使样品中的被测组分能更快的提取出来。,二、样品的提取,方法,1.冷浸法 2.回流提取法 3.连续回流提取法 4.超声提取法 5.
3、超临界流体提取法,三、样品的分离净化,方法,1.沉淀法 2.蒸馏法 3.液-液萃取法法 4.色谱法 5.固相微萃取技术 6.消化法,第二节 测定方法的验证,分析方法验证的目的是证明采用的方法是否适合于相应检测要求。在建立中药质量标准时，分析方需经验证；在处方、工艺等变更或改变原分析方法时，也需对分析方法进行验证。方法验证过程和结果均应记载在药品质量标准起草说明或修订说明中。,验证内容有： 准确度 精密度(包括重复性,中间精密度,重现性) 专属性、 检测限、定量限、 线性、范围 耐用性。,一、准确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（%）表示。准确度应在规定的
4、范围内测试。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。,1、测定方法的准确度 可用已知纯度的对照品做加样回收测定，即于已知被测成分含量的供试品中再精密加入一定量的已知纯度的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。,在加样回收试验中须注意对照品的加入量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入的对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。 回收率%=（C-A）/B100%,2、数据要求 在规定范围内，取同一浓度的供试品，用6个测定结果进行评价，或设计3个不同浓度，每个浓度各分别制备3份供试品溶液进行测定
5、，用9个测定结果进行评价，一般中间浓度加入量与所取供试品含量之比控制在1：1左右。,二、精密度 精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差的相对标准偏差表示。 精密度包含重复性、中间精密度和重现性。,三、专属性 专属性系指在其他成分可能存在的条件下，采用的方法能够正确测定出被测成份的特征。 考察一个分析样品的专属性时，应着重考察共存组分是否对被测组分的测定有干扰。,四、线性 线性系指在设计的范围内,测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。 应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一
6、系列供试品的方法进行测定，至少制备5个浓度的供试品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归。,五、范围 系指能达到一定精密度,准确度和线性,测试方法适用的高低限浓度或量的区间。 范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对于有毒的、具特殊功效或药理作用的成分，其范围应大于被限定含量的区间。,六、耐用性 系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据，开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。 经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。,第三节 常用定量分析方法,一、
7、化学分析法,包括重量分析和滴定分析 所用仪器简单，结果准确，主要用于制剂中含量较高的一些成分或矿物药 制剂中的无机分析 灵敏度低，操作繁琐，耗时长，专属性不高，对微量成分测定的准确性不理想,（一）重量分析法 分为挥发法，萃取法和沉淀法 挥发法：测定具有挥发性或定量转化为挥发性物质的组分含量 萃取法：根据被测组份在互不相溶的两相中溶解度不同，达到分离的目的 沉淀法：将被测组份定量专为难溶性化合物，测定其含量的方法，适用于制剂中纯度较高的成分。,（二）滴定分析法 分为酸碱滴定，沉淀滴定，配位滴定，氧化还原滴定等 酸碱滴定法适用于中药制剂中所含的生物碱，有机酸组分的含量 沉淀法分为银量法，四苯硼钠法
8、和亚铁氰化钾法等，中药用于测定生物碱，生物碱的氢卤酸盐以及含卤素的其他有机成分的含量。,常用的配位滴定法包括EDTA法和硫氢酸铵法，用于测定鞣质、生物碱及含有Ca2+、Mg2+、Fe3+，Hg2+等矿物类制剂的含量 氧化还原滴定法适用于测定具有氧化还原性的物质。,是中药及其制剂含量测定的常用方法，具有灵敏度高，精度好，造作简单等优点。 要求被测组分本身或其显色产物对可见-紫外光具有选择性吸收。 按测定波长不同可分为单波长光度法和计算分光光度法。,二、可见-紫外分光光度法,（一）单波长光度法 测定前，必须经过适当的提取，净化，或采用专属的显色反应等步骤来排除干扰。 选择max进行定量分析，而共存
9、组分在此波长处基本无吸收 吸收度读数控制在0.3-0.7之间,1. 吸收系数法 按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时，吸收系数通常应大于100，并注意仪器的校正和检定。,2 对照品比较法 按各品种项下的方法，分别配制供试品溶液和对照品溶液，对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分规定量的10010,所用溶剂也应完全一致。,3.标准曲线法 先配制一系列浓度不同浓度的对照品溶液,在相同条件下测定吸收度,绘制A/C曲线或求出其回归直线方程（r0.999）,即得标准曲线。在相同条件下测定供试品的吸光度,求得供试
10、品中被测组分的浓度或含量. 在比色法中最常用.,（二）计算分光光度法 供试液中若有两种（两种或两种以上）组分共存，其紫外光谱彼此发生不同程度的重叠时，则可通过测定多个波长处的吸收度，根据吸收度的加和性，采用适当的数学处理方式进行多组分的同时测定，或者用其排除共存组分的干扰，测定其中某个组分。,三.薄层色谱扫描法 系指用一定波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中可吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能发射出荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别、检查或含量测定。,同HPLC相比：具有实验成本低，流动相的选择与更换方便等优点 是药物制剂中常用的分析方法之一 2005版中国药典中
11、有35中中成药的含量测定才有薄层扫描法,（一）基本原理 一般是指波层色谱斑点的色谱扫描 固定波长，斑点移动，测定A-l或F-l曲线 根据波层扫描的测定方式可分为薄层吸收扫描法和薄层荧光扫描法,1.薄层吸收扫描法 适用于在可见、紫外区有吸收的物质，及通过色谱前或色谱后衍生成上述化合物的样品组分，可分别以氘灯和钨灯为光源，在200-800nm波长范围内选择合适波长进行测定。 斑点中物质的浓度与吸光度的关系需要用Kubelka-Munk理论及曲线来描述,Kubelka-Munk理论以斑点的相对反射率和相对透光率表示薄层色谱斑点的吸光度，说明了固定相的散射参数SX对斑点中物质的浓度与吸收度间关系的影响
12、，从而获得不同散射参数SX时斑点的A-KX理论曲线，即Kubelka-Munk曲线。 Kubelka-Munk曲线时薄层扫描法进行定量分析的理论依据,2.薄层荧光扫描法 适用于本身具有荧光或经过适当处理后可产生荧光的物质的测定，光源用讪灯或汞灯，采用直线式扫描。 专属性强，灵敏度比吸收法高1-3个数量级，最低可测到10-50pg样品，但使用范围窄,当溶液浓度很稀时(ECl0.05)，荧光强度与激发光强I0及物质的浓度C的关系为 F=2.3KI0ECl 或F=KC K为常数（与荧光效率有关），L为薄层板厚度，E为吸光系数,Kubelka-Munk理论不适用于薄层荧光扫描，无需进行曲线校直 用薄层
13、荧光扫描进行定量分析时，用斑点荧光强的的积分值与斑点中组分的含量代替上式中的F与C进行运算。,（二）定量分析方法 1.方法学考察 （1）工作曲线 目的是： 检验所选择的散射参数SX是否合适 考察工作曲线是否通过原点，以便确定采用一点法或两点法定量 确定点样量的线性范围,（2）分离度： 用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离（R）的计算公式为： R=2（d2-d1）/(W1+W2) 式中：d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离； W1及W2为相邻两峰各自的峰宽。 除另有规定外，分离度应大于1.0。,（3）重复性 同一供试品溶液在同一薄
14、层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%；需显色后测定的相对标准偏差应不大于5.0%。,（4）准确度考察 常用加样回收率来衡量，其值应在95%-105%之间，测定数据一般为5-6个 （5）统计检验 包括F检验和t检验,2.定量方法,（1）外标法 （2）内标法 （3）回归曲线定量法,外标一点法 外标两点法,四、气相色谱法 （一）基本原理 气化后的试样被载气带入色谱柱，由于各组分在两相间的作用不同，在色谱柱中移动有快有慢，经一定柱长后得到分离，以此被载气带入检测器，将各组分浓度或质量变化转化为电信号变化记录为色谱图，利用色谱峰保留值进行定性分析，利用峰面积或峰高进行定量
15、分析。,(1) 色谱柱的理论板数(n),n,（ ）,tR,=5.54,tR,W1/2,=16,（ ）,tR,W,（ ）,2.速率理论,H=A+B/u+Cu,3.分离度,2(tR2tR1) R W1W2,4.系统适应性 （1）色谱柱的理论塔板数 （2）分离度 R1.5 （3）重复性 2.0% （4）拖尾因子 0.95-1.05,（二）实验条件的选择 1.固定相的选择 2.柱温的选择 3.载气的选择 4.其他条件的选择 5.检测器,（三）定量分析方法,（1）内标法加校正因子 （2）外标法 （3）归一法 （4）标准溶液加入法,五、高效液相色谱法 （一）基本原理,(1) 色谱柱的理论板数(n),n,（ ）,tR,=5.54,tR,W1/2,=16,（ ）,tR,W,（ ）,2.速率理论,H=A+Cu,（二）实验条件的选择 .色谱柱选择 .流动相选择 .洗脱方式 .检测器 .前处理,（三）法分类及方法,.键合相色谱法,.胶束色谱法,.反相键合相色谱 .正相键合相色谱 .离子对色谱法 .离子抑制色谱法,六、荧光分析法 七、原子吸收分光光度法,
