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1、基因的表达与调控（上） 原核生物的基因调控,一、绪论,原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应毫无保障，只有能根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。,假如在大肠杆菌内，平均一个基因1000bp，一个细胞中约有2500-3000个基因。正常情况下，可带有107个蛋白质，平均每个基因产生3000多个蛋白质分子。 但实验却表明，每细胞中有些蛋白质少之10个分子，而有一些却多达500000个分子。,一个大肠杆菌中只有15个分子的半乳糖苷酶，若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每细胞中酶量可高达几万个分子，其合成的速度和总量随环境的
2、变化而改变。 表明基因的表达受到调控。,细菌在进行调控时： 一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种“开-关”（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。,1、基因表达及基因表达调控 是指生物体基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录及翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定生物学功能的全过程,称为基因表达（gene expression）。 对这个过程的调节就称为基因表达调控（gene regulation或gene control）。,基因表达调控主要表现在以下几个方面： 转录水平上的调控(transcriptional regulati
3、on)； mRNA加工成熟水平上的调控(differential processing of RNA transcript)； 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA)。,2、基因表达调控的基本原理 多级调控:主要是转录水平的调控 四个基本的调控点： 基因的结构活化 转录起始：最有效的调节环节 转录后加工及转运 翻译及翻译后加工,3、基因表达的调控方式 负调控（negative transcription regulation）: 调控蛋白+DNA序列 基因表达(相应蛋白质降低) 正调控（positive transcription regulati
4、on）: 调控蛋白+DNA序列 基因表达 (相应蛋白质增加),负调控,根据作用特征,负控诱导,负控阻遏,正调控,根据作用特征,正控诱导,正控阻遏,正调控与负调控并非互相排斥的两种机制，而是生物体适应环境的需要，有的系统既有正调控又有负调控； 原核生物以负调控为主，真核生物以正调控为主； 降解代谢途径中既有正调控又有负调控；合成代谢途径中一般以负调控来控制产物自身的合成。,主要环节在转录，起始因子决定RNA聚合酶识别特异性。,操纵子（operon）： 原核生物中几个功能相关的结构基因成簇串联排列组成的一个基因表达的协同单位（DNA序列）。 一个操纵子 编码序列（2-6）+启动序列+操纵序列+(其
5、他调节序列),二、原核基因调节特点,1、乳糖操纵子的发现： 葡萄糖充分时： 葡萄糖代谢有关的酶基因-表达 其他糖代谢有关的酶基因-关闭 葡萄糖耗尽时,乳糖存在： 乳糖代谢有关的酶基因 -表达 葡萄糖代谢有关的酶基因-关闭 说明酶可以诱导,一）乳糖操纵子(lactose operon),乳糖的利用及其相关的酶: 乳糖 (在通透酶作用下进入细菌） 别位乳糖 葡萄糖+半乳糖,半乳糖苷酶,乳糖的利用,半乳糖苷酶,乳糖确实可诱导Lac mRNA的合成,能以乳糖作为唯一碳源和能源生长的定为lac+；相反，称之为lac-。,安慰诱导物（gratuitous inducer）,诱导物的加入和去除对lac mR
6、NA的影响,2、结构基因顺序 乳糖操纵子包括三个结构基因：Z、Y、A,P,Y,Z,A,O,转录方向,A 模型的提出,1940年，Monod发现细菌“二次生长曲线”； 1950年，Monod和Tacob发现两对基因Z和I； Szilard发现I基因决定阻遏物的合成； Jocob提出结构基因旁边还有开关基因，即操纵基因。,J.Lederberg 1948 不同Lac-突变型 细菌结合转移和转导试验 证明三基因紧密连锁,B 实验验证 结构基因,Lac Z-Y+A+：- 半乳糖苷酶基因突变,Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶。 -半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷键的专一
7、性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。 -半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 -半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,在这些突变体中，有一类突变体，它体内的半乳糖苷酶的形成不依赖于诱导物的存在，即没有乳糖或别的半乳糖苷存在时也能合成- 半乳糖苷酶，这种突变体称为组成型突变。分为两类：I型和O型。 I型：野生型为I+，突变型为I-； O型：野生型为O+，突变型为Oc。,调节基因,I+I-或O+ Oc后，Z、Y、A结构基因均表现为永久表达，所以I基因
8、被称为调节基因(regulatory gene)。 I基因是一个产生阻遏物的调节基因，其产物使体系关闭。I-突变体由于不能产生阻遏物，使细胞成为lac永久表达型。I-/I+局部二倍体由于带有一个正常阻遏物，使细胞中的lac仍然被抑制。, I 型组成型突变,Hfr lac I+Z+strST6S,F- lac I-Z-strrT6r,培养无诱导物,混合培养,1小时后加入抗生素 杀死供体菌,- 半乳糖苷酶活性逐渐上升,2小时后 加诱导物,组成型变为诱导型,说明： I+合成特异的阻遏物，无诱导物时可阻止Z基 因表达 诱导物可作为阻遏物的拮抗物，使阻遏物失活， Z基因表达 I-不产生无活性阻遏物，因而
9、无需诱导物，Z基 因就可表达，阻遏物起负调控作用,I基因产物及其功能,1967年 W.Gilbert 和B.Miller Hill将 lac I+ 或lac I- E.coli细胞提取物分别与放 射性标记的IPTG混合，发现lac I+ E.coli细胞 提取物中有某种蛋白质可以与IPTG结合，且每 个蛋白分子可以与4个IPTG分子结合，而lac I- E.coli细胞提取物中没有这种蛋白质与IPTG结 合，说明与IPTG结合的蛋白是I基因的产物。,lac I+ 的离体反应液（35S标记的I基因的产物）与不同的DNA分子相互作用，发现I基因的产物 不与失去lac操纵子全部基因的DNA分子结合
10、在有IPTG时不与lac操纵子基因结合 不与lacOC突变体的DNA分子结合 说明 I基因的产物有两个结合位点,阻遏蛋白: N端: 159aa头部片段：为HTH，与操纵基因DNA的大沟结合； 核心区：有6个折叠，诱导物就结合在两个核心区之间的裂缝中； C端: 为两组亮氨酸拉链，形成四聚体。,活性阻遏蛋白的另一个重要特点是形成四聚体 等位基因间的互补（interallelic complementation）,不同等位基因编码的亚基可相互缔合形成杂合多聚体， 其性质不同于任何一种纯合多聚体。,Uninducible lacI S mutations are dominant,Constituti
11、ve lacI d mutations are dominant,组成型 表达,不可 诱导,Lac阻遏物 结构特点 调控机制 （负调控）,由基因I编码生成的蛋白质 具有四级结构的蛋白质 具有4个相同亚基，每个亚基中都有一 与诱导剂和O基因结合的位点 Lac阻遏物与O基因结合： 结构基因关闭 Lac阻遏物与诱导剂结合： 不与O基因结合，结构基因开放 RNA聚合酶结合，转录开始, Lac阻遏物,I,O,O,诱导剂,乳糖操纵子的负调控,O+Z+ - OcZ+ OcZ+/O+Z+ OcZ/OZ+ OcZ+/OZ ,基 因 型,组成表达,诱导表达,操纵基因 O基因组成型突变,说明： Oc对O+显性，但只
12、对其临近的基因才有作 用，称为顺式显性。,顺式显性（cis-dominant)：显性效应只对处于同一染色体上它所调控的结构基因才起作用的现象,遗传学图谱分析指出，Oc突变位于I与Z之间，所以，lac体系的4个基因的序列为IOZY。通过这些观察，Jacob和Monod推断Oc突变代表DNA链上的一个位点或一个非编码区域，而不是一个基因，因为可编码的基因具有互补性，而Oc没有这一特性。 O决定相邻Z基因的产物是诱导型合成还是组成型合成，O区域称为操纵基因。,操纵基因的结构,特点：-7-+28，以+11为对称轴 典型特征具有反向重复序列 相互作用位点可以缩小在+5-+17,I,P,O,Z,Y,A,调
13、控基因 控制位点 结构基因,DNA,阻遏蛋白,启动序列,cAMP-CAP结合位点,操纵序列,半乳糖苷酶,通透酶,乙酰基转移酶,3、乳糖操纵子（lactose opron） 结构,RNA聚合酶 结合位点,（6759）,（728）,General organization of the lac operon of wild-type E. coli. Order of controlling elements and genes: lacI: promoter-lacI-terminator operon: promoter-operator-lacZ-lacY-lacA-terminator,-
14、54 -58 -65 -69,-47 -8,-3 +21,AUG：+39 +41,-47 -84,1）P-O区 Promotor: -84-+ 1 Operator: -7-+28 两者有7bp重叠，使这段序列可能无法同时结合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能虽然可以同时结合，但无法形成开放的转录起始复合物,2）Lac阻遏物的作用-负调控,没有乳糖存在时,Lac阻遏物的作用-负调控,有乳糖存在时,3）诱导物的作用机制 a诱导模式 平衡模型（间接作用）：DNA结合的阻遏蛋白和游离的阻遏蛋白迅速平衡，加入诱导物后，诱导物结合到游离的阻遏蛋白上，打破了平衡，从而导致结合的阻遏蛋白释放,阻遏蛋白从操纵基因
15、上解离下来的速率非常低以至不能和平衡模型相吻合。,b 解离模型（直接作用）：诱导物直接和结合在操纵基因上的阻遏蛋白相互作用。可能通过改变其构象使其离开操纵基因。,4）两个矛盾,第一个诱导物如何进入细胞？ 第一个-半乳糖苷酶如何产生？ 解释： 本底水平表达,在非诱导状态下有少量（1-5个mRNA分子）lac mRNA合成。由于阻遏物的结合并不是绝对紧密，即使在与操纵基因紧密结合时，也会偶尔掉下来，这时启动子的阻碍被解除，RNA聚合酶开始转录，导致在非诱导情况下少量透过酶可以合成。 mRNA的这种合成称为本底水平表达。,5）CAP-cAMP复合物在乳糖操纵子表达中 的作用-乳糖操纵子的正调控,1965年， Sutherland 发现大肠杆菌培养液中葡萄糖的含量总是与cAMP含量成反比。 1968年，发现大肠杆菌培养液中加入cAMP可增加半乳糖苷酶的产量。,葡萄糖消耗完,Adenylate cyclase converts ATP into cAMP. Phosphodiesterase converts cAMP to AMP. Glucose cat
