《基因工程的操作过程1》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基因工程的操作过程1(104页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、第四章 基因工程的操作过程,一、DNA的体外重组(切、接) 二、重组DNA分子的转化和扩增(转、增) 三、转化子的筛选和鉴定(检),一、DNA的体外重组(切与接),1、相同粘性末端的连接 2、平末端的连接 3、不同粘性末端的连接 4、人工粘性末端的连接 5、酶切位点的定点更换 6、重组率,同种限制酶产生的粘端的连接 同尾酶产生的粘端的连接,1、相同粘性末端的连接:,同种限制酶产生的粘端的连接,5,5,AATTC,G,同尾酶产生的粘端的连接,2、平末端的连接:,提高平端连接效率的方法:,加大连接酶用量(10倍于粘端连接, 1-2U);,加大平端DNA片段的浓度;,加入10% PEG 8000;,
2、加入单价阳离子(NaCl),终浓度150-200 mM。,16连接过夜(粘端连接16 4hr或4过夜);,3、不同粘性末端的连接:,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,G,CTTAA 5,5,5 AATTC,G,BamH I,EcoR I,目的基因,1)两种DNA分子都有5突出末端:,2)两种DNA分子都有3突出末端:,3)一种DNA分子有5突出末端,另一种有3突出末端:,4)两种DNA分子都有2个不同的粘性末端:,4、人工粘性末端的连接:,5突出末端,3突出末端,平末端,1)平末端人工粘性末端的连接,2) 5突出末端人工粘性末端的连接,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,G,
3、CTTAA 5,5,5 AATTC,G,目的基因,3) 3突出末端人工粘性末端的连接,5、酶切位点的定向更换,6、重 组 率,在常规实验条件下,重组率一般为25-75%。,提高重组率的方法:,加装同聚尾。,提高外源DNA片段与载体的分子比:5:1-10:1;,载体DNA分子在连接前去除5-P;,载体DNA分子在连接前先去除5-P:,5,G,CTTAA,5 AATTC,G,目的基因,加装同聚尾:,二、重组DNA分子的转化和扩增(转与增),转化技术及其原理 转化率 转化细胞的扩增,转化:,将DNA重组分子导入特定的受体细胞,使之无性繁殖,高效表达外源基因,或直接改变其遗传性状,这一过程及操作称为D
4、NA重组分子的转化(transformation)。,Ca2+诱导转化法 原生质体转化法 噬菌体DNA的转染 电穿孔转化法 三亲本杂交转化法,1、重组DNA分子导入原核细胞,1)Ca2+诱导转化法:,Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构,后者经热脉冲发生收缩作用,使细胞膜出现空隙,细菌细胞此时的状态称为感受态。,适用于革兰氏阴性菌(如E.coli)。,感受态细胞的制备,感受态细胞的转化,制备感受态菌必须使用对数生长期的菌;,必须在冰冷的条件下制备;,CaCl2悬浮菌体要充分;,储存感受态菌要在-70以下;,使用感受态菌时,必须在手里或水浴迅速融化,融化后不能再次冻存使用。,注意事项:,2
5、)原生质体转化法:,革兰氏阳性菌(如枯草杆菌、链霉菌等)接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁,常采用原生质体(细胞去壁后形态)转化法。,也适用于酵母、真菌、植物细胞。,细菌原生质体转化流程,细菌原生质体的制备 细菌生长于高渗培养基(如34%蔗糖溶液)中, 加入甘氨酸以增加细胞壁对溶菌酶的敏感性。 制备过程中,菌体始终悬浮在10.3%蔗糖等渗溶液。,3)噬菌体DNA的转染:,必须先在体外将重组-DNA包装成有感染力的重组噬菌体颗粒。,用于体外包装的蛋白已商品化,通常为互补两部分:一部分缺少E组份,另一部分缺少D组份。当这两部分同时与重组-DNA混合时,包装才能有效进行。,噬菌体DNA转染流程,感受态
6、细胞的培养 将E.coli培养至OD600=0.5。,4)电穿孔转化法(electroporation):,几乎对所有含细胞壁结构的细胞有效。,将重组DNA加入电穿孔转化仪的样品池,两极施加瞬时高压电场。在强大电场作用下,细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙,重组DNA分子进入细胞。,电穿孔转化的流程,5)三亲本杂交法(triparental mating):,被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌、含广泛宿主辅助质粒的辅助菌共培养,在辅助质粒的作用下,重组DNA分子被转移到受体菌细胞内。,当重组DNA分子不能直接转化受体菌时,可采用三亲本杂交转化法。,2、重组DNA分子导入植物细胞,根癌农杆菌介导的
7、Ti质粒转化法 植物病毒介导的转染 电穿孔转化法 基因枪转化法 激光微束穿孔法 多聚物介导法 花粉管通道法,根癌农杆菌(A.tumefaciens)是普遍存在土壤中的革兰氏阴性菌,能在自然条件下特异性感染几乎所有双子叶植物(尤其豆科类植物)的根部和受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤。,1)根癌农杆菌介导的Ti质粒转化法,根癌农杆菌的致瘤特性是由其细胞内的野生型Ti(Tumor-inducing)质粒介导的。,根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,将T-DNA插入植物基因组中,随其复制而复制。,用携带外源基因的Ti质粒转化植物原生质体,外源DNA与植物染色体DNA整合,通过原生质体的培养分化成愈伤组织,
8、最后发育成具有新性状的完整植株-转基因植物。,病毒载体能将外源基因导入植物所有组织和细胞中,且不受单子叶或双子叶的限制。,如:以花椰菜花斑病毒(CaMV)基因组为载体,去除致病基因,换上外源基因,体外包装成有感染力的病毒颗粒,转染植物细胞原生质体,由此再生成完整植株。,2)植物病毒介导的转染,3)电穿孔转化法:,将重组DNA加入植物细胞原生质体中,在200-600V/cm电场中处理若干秒,然后将原生质体在组织培养基中生长1-2w,再生出完整植株。,4)基因枪转化法:,又称微弹轰击法,1987年由美国康奈尔大学的Sanford发明。,将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面,借助高压动力射入
9、受体细胞或组织,整合到植物基因组中并得以表达。,基因枪工作原理,真空加速管,压缩氨气,吸附微粒的膜,包裹DNA的金属颗粒,目标细胞,枪的威力430 m/s,5)激光微束穿孔法:,利用直径小、能量高的激光微束可引起细胞膜可逆性穿孔的原理,在荧光显微镜下用激光处理细胞,处于细胞周围的重组DNA随之进入细胞。,最适于活细胞中线粒体和叶绿体等细胞器的基因转移。,6)多聚物介导法,聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等是协助DNA转移的常用多聚物,以PEG应用最广。,这些多聚物同二价阳离子和DNA混合,可在原生质体表面形成颗粒沉淀,促使DNA进入细胞内。,7)花粉管通道法,授粉后向子房注射外源DN
10、A,利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道,将外源DNA导入受精卵细胞,整合到基因组中,随受精卵发育而成为转基因植物。,1983年,由我国中科院周光宇提出。,我国推广面积最大的抗虫棉即是花粉管通道法培育出来的,占黄河、长江流域棉区种植面积的78.6%,占全国种植面积的60%以上。,3、重组DNA分子导入哺乳动物细胞,DEAE-葡聚糖转染法 磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 病毒颗粒转染法 显微注射法 电穿孔法,1)DEAE-葡聚糖转染法:,DEAE-dextran(二乙胺乙基葡聚糖)是一种高分子多聚阳离子试剂,能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA。,2)磷酸钙转染法:,哺乳动物细胞能捕获粘附在细胞
11、表面的DNA-磷酸钙沉淀,使DNA进入细胞。,将DNA和CaCl2溶液混合,然后缓慢滴入磷酸盐缓冲液PBS中,形成DNA-磷酸钙沉淀,粘附到细胞膜并通过胞饮进入细胞。,3)脂质体介导法:,脂质体是人工构建的、由磷脂双分子层组成的膜状结构,将外源DNA包裹其中,通过脂质体与细胞膜接触,可将外源DNA导入受体细胞。,转染率比裸DNA高100倍。如用PEG预处理受体细胞,可提高转染率10-20倍。,4)显微注射法(microinjection),鉴于哺乳动物细胞便于注射的特性,常利用显微注射法,直接把外源DNA注射到宿主细胞核里,使其整合到染色体上。,显微注射法的流程,5)病毒颗粒转染法:,病毒基因
12、组为缺陷型,需辅助病毒一起感染受体细胞;,病毒直接感染受体细胞,目的基因随病毒DNA整合到其染色体DNA上;,病毒基因组为缺陷型,但受体细胞基因组中整合了病毒缺失的基因,无需辅助病毒。,腺病毒(adenovirus) 腺相关病毒(adeno-associated virus) 逆转录病毒(retrovirus) 慢病毒(lentivirus) 杆状病毒(baculovirus) 痘病毒(poxvirus),常用的病毒载体:,4、转化率,在一般的转化实验规模下,每个受体细胞最多只能接受1个载体分子,因此转化率的定义也可表征为:1g载体DNA转化后,受体细胞接纳DNA的个数,即克隆数。,转化率是衡
13、量转化效率的重要指标。 转化率=1g载体DNA进入受体细胞的分子数。,按转化1g pUC18需21010个感受态细胞,则每 个细胞中有1个细胞接纳pUC18 DNA。,3400,如:pUC18对E.coli细胞的转化率为108,则1g pUC18中有108个分子进入受体细胞。,按1g含3.41011个分子,则每 个pUC18分子中有1个分子进入受体细胞。,200,影响转化率的因素:,载体及DNA重组子方面 受体细胞方面 转化方法方面,1、载体及DNA重组子方面:,1)载体本身的性质:,不同载体转化同一受体细胞,转化率不同。,2)载体的空间构象:,经切、接操作后的载体DNA,因空间构象难以恢复,
14、转化率比超螺旋结构的质粒低2个数量级。,质粒的超螺旋构象转化率最高;,3)插入片段的大小:,重组质粒分子量越大,转化效率越低。大于20kb的重组质粒很难进行转化。,2、受体细胞方面:,如:pBR322转化大肠杆菌JM83,转化率很低(103/g DNA);但对ED8767株的转化率则较高(106/g DNA)。,受体细胞必须与载体匹配。,3、转化方法方面:,1)受体细胞的预处理:,对Ca2+转化而言,菌龄、Ca2+处理时间、感受态细胞的保存期、热脉冲时间等均为影响因素。感受态细胞在12-24h内转化率最高,分装后可在-70保存几个月。,感受态细胞的制备对转化率影响最大。,2)供受体的比例:,通
15、常50-100ng的DNA对应于109个受体细胞或原生质体,加大DNA量并不能线性提高转化率,甚至使转化率下降。,DNA分子数与受体细胞数的比例对转化率也有影响。,3)转化方法:,不同转化方法的转化率不同。,5、转化细胞的扩增,指转化完成后细胞的短时间培养,往往与转化偶联在一起。,如:Ca2+诱导转化后的37培养1hr; 原生质体转化后的再生过程; -噬菌体转染后的30培养。,扩增的目的:,增殖转化细胞,以获得足量的细胞用于筛选;,扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;,表达外源基因,便于筛选和鉴定。,三、转化子的筛选和鉴定(检),根据载体遗传标记检测,外源基因产物检测,目的基因序列检测,
16、重组率和转化率不可能达到100%的理想极限,必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。,非转化子:,转化子:,重组子:,非重组子:,非目的重组子:,目的重组子:,接纳载体或重组DNA的转化细胞;,未接纳载体或重组DNA的转化细胞。,含重组DNA的转化子;,仅含空载体的转化子。,含目的基因的重组子;,不含目的基因的重组子。,1、根据载体标记筛选:,1)抗药性筛选法:,可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。,Ampr、Tcr,Ampr、Tcs,基本操作:,2)营养缺陷型筛选法:,原理: 载体分子携带某种营养组份的合成基因,而受体细胞本身不能合成这一营养组份。 在不含此营养组份的培养基上长出的便是转化子。,可区分转化子与非转