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1、二、依赖于重组子结构特征分析筛选,(一)快速裂解菌落鉴定分子大小 主要是根据有外源DNA片段插入载体后的重组DNA与载体DNA之间的大小差异来鉴定重组子。 分别提取不同转化子的DNA，经琼脂糖凝胶电泳，由于重组DNA是载体DNA中插入了外源DNA片段，其分子量大于载体DNA分子，在琼脂糖凝胶板上出现的DNA带中，落后的带是重组DNA的带。 这是对重组子进行分析鉴定的最基本、最简单的方法，直观快捷，只须获得质粒DNA分子的粗制裂解液即可进行琼脂糖凝胶电泳，尤其适用于插入片段较大的重组子的筛选。 此方法只用于重组子的初步鉴定。,(二)限制性内切核酸酶消化 载体被外源片段插入后，其限制性酶切割产物会
2、发生变化，可根据电泳结果来判断外源基因是否插入了载体及其插入方向。 通过快速裂解菌落鉴定分子大小的方法难以区分期望重组子和非期望重组子，因为重组质粒DNA分子中，质粒载体可能会与一个以上的外源DNA片段连接重组。 采用限制性核酸内切酶分析法不仅可以进一步筛选鉴定重组子，且能判断外源DNA片段的插入方向及分子质量大小等。 基本做法是从转化菌落中随机挑选出少数菌落，快速提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶酶解，并通过凝胶电泳分析来确定是否有外源基因插入及其插入方向等。,完全酶切,简单操作过程是，用一种或两种能将外源DNA片段从重组质粒上切割下来的限制性核酸内切酶酶解质粒DNA，凝胶电泳后重组质粒分子
3、较单一载体质粒多出一条泳带，据此将重组子和非重组子分离开来。如果插入片段与载体质粒大小相近，则最好用合适的酶将之线性化，通过比较大小确定其是否为重组分子。进一步利用在外源DNA片段上具有识别位点的一种或一种以上的限制性核酸内切酶酶解重组质粒分子，根据酶切图谱分析即可判明插入片段的方向等。,部分酶切,通过一种或数种限制性核酸内切酶对重组质粒DNA分子进行部分酶解分析，根据部分酶解产生的限制性片段大小，确定限制性核酸内切酶识别位点的准确位置及各个片段的准确排列方式，从而将期望重组子筛选出来。 部分酶解法较全酶解法简单易行，两者通常用于当载体和外源DNA片段连接后产生的转化菌落比任何一组对照连接反应
4、(如只有酶切后的载体或只有外源DNA片段)都明显多时的重组筛选。,三、核酸分子杂交分析,(一)分子探针 分子探针是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子或蛋白质分子。,分子杂交,核酸杂交：两种不同来源单链DNA或RNA相互配对的过程。 分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互作用。,理想的探针标记物应满足的条件： 1)标记物不会影响探针的主要理化性质，如杂交特异性、杂交稳定性及酶反应待征等； 2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、重
5、复性好； 3)操作简便、省时经济实用： 4)化学稳定性高、易于长期保存； 5)安全、无环境污染。 常用于分子杂交的探针标记物可分为放射性及非放射性两大类。,1.放射性标记物,放射性标记物是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的产物，常见的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其中以32P、3H、35S最为常用。 32P标记的核苷酸具由高放射性，放射自显影检测灵敏度高，但其分辨力低，半衰期短(14.3d)，探针不能长期保存。 与32P标记物相比，35S的放射性较弱，检测灵敏度低，但其分辨力高，放射自显影的本底低，适于细胞原位杂交等。半衰期较长(87.1d)，辐射危害较小，使用较
6、为方便安全。 3H主要用于制备高分辨力的原位杂交探针，因其释放的放射能很低，放射自显影的本底也不高但却需较长的曝光时间。半衰期长(12.35a)，标记探针可较长时间保存。 标记物放射性的检测主要使用盖革计数器和液体闪烁计数器等射线探测仪来完成。,2.非放射性标记物,非放射性标记物的最大优势是无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，但与放射性探针相比，多数非放射性探针的敏感性及特异性较差。 目前已广泛应用的非放射性标记物有生物素(biotin)标记的核苷酸、地高辛(digoxigenin)标记的核苷酸和荧光素(fluorescein)标记的核苷酸等。此外，乙酰基氨基芴(AAF)或
7、乙酰基氨基碘芴(AAIF）、汞离子、金颗粒、银颗粒及磺基等标记的核苷酸也能作为标记物使用。,3.探针标记方法,探针的标记有体内标记及体外标记两种方法。 体内标记法是以标记化合物作为代谢底物，通过活体生物或活细胞的体内代谢完成核酸分子标记，例如在培养基中加入3H-胸苷，就可以标记到生长在该培养基中的活细胞DNA分子上。 体内标记法受多种因素的限制，且标记活性不高，一般很少使用。,体外标记,包括化学法和酶法两种。 化学标记法是利用标记物的活性基团与核酸分子中的某种基因(如磷酸基团)发生化学反应而直接将标记物连接到探针分子上，具有简单快速、标记均匀的特点，尤其适于制备非放射性标记物的探针。 常用的化
8、学标记法有光敏标记法、化学衍生结合标记法和交叉相连法等。 酶标记法则是先将标记物标记在核苷酸上，然后通过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，获得核酸探针。酶法应用广泛，适于制备所有放射性标记探针及部分非放射性标记探针。 常用的酶法有DNA缺口平移标记法、DNA随机引物标记法、DNA末端标记法及PCR标记法等。,(1)切口平移标记法,DNA聚合酶,该法标记模板链,(2)随机引物标记法,Klenow片段催化,该法标记模板互补链,随机引物是含有各种可能排列的寡核苷酸片段的混合物。,随机引物：46 使用随机引物标记的探针一般长400-600个核苷酸，具多种序列，但都与模板互补。与切口平移法不
9、同的是，该方法标记的是模板互补链，而非模板本身。,(二)核酸探针杂交分析,基本原理是：具有一定同源性的两条核酸(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。 该技术也可用于重组子的筛选鉴定，杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段(称为探针)。,核酸分子杂交技术： 具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下, 可按碱基互补配对原则特异性地复性，形成双链。,探针(已知核酸片断，单链),待测核苷酸序列(单链),Blot:是将待测生物大分子结合到一定的固相支持物上的方法。(这些结合在固相支持物上的生物分子即可与
10、存在于液相中的探针分子进行杂交。) 固相支持物与有效的转移方法是此技术的成败关键。,基本做法是将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜(或尼龙膜)上，这个过程也称为核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交结合，洗去其他的非特异结合核酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异DNA片段所在的位置。 根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同，核酸分子杂交检测法可分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern印迹杂交和Nothern印迹杂交四类。,核酸分子杂交是核酸分析的重要方法，是鉴定重组DNA的最通用方法 杂交方法 适用范围 菌落印迹杂交
11、 检测细菌体固定在膜上后， 经裂解释放的DNA 斑点杂交 检测未经凝胶电泳分离的， 固定在膜上的DNA或RNA 原位杂交 直接检测细胞或组织中的DNA或RNA Southern 印迹杂交 检测经酶切、凝胶电泳分离的， 已转移到膜上的DNA Northern印迹杂交 检测经凝胶电泳分离的， 已转移到膜上的RNA,(1)Southern印迹杂交,Southern blot DNA杂交由 E.Southern于1975年提出。 DNA琼脂糖凝胶电泳 转移到NC膜上 DNA或RNA探针杂交 放射自显影显杂交带 Southern印迹杂交，有时又称为DNA印迹杂交或Southern DNA印迹杂交等。,它
12、是根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。,其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。 该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。,Southern杂交,纪念发明者 Edward Southern （1）提取总DNA （2）酶解 （3）电泳 （4）转移到滤膜 （5）变性解
13、链 （6）DNA探针及杂交 （7）洗脱 （8）放射自显影 （9）比较分析,Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bgl(A-C)、BamH（D-F）、EcoR（G-I）、和Hind（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻的psbA基因序列,在印迹技术中，硝酸纤维素滤膜是目前应用最广的一种固相支持物，但它也存在一些不足之处： 第一、硝酸纤维素滤膜是依赖疏水性相互作用结合DNA的，这种
14、结合并不十分牢固。 第二、硝酸纤维素滤膜质地校脆弱，容易碎裂，因此操作须小心谨慎(待别是经烘烤后)。 第三、硝酸纤维素滤膜与核酸的结合有赖于高盐浓度，在低盐浓度时结合DNA效果不佳，不适宜于电转印迹法。 第四、硝酸纤维素滤膜对于小分子质量的DNA片段(特别是小于200bp的DNA片段)结合能力不强。,硝酸纤维素滤膜,尼龙膜,现在人们更倾向于使用尼龙膜。 尼龙膜结合DNA和RNA的能力强于硝酸纤维素滤膜，对小分子质量的核酸也能较好地结合，经烘烤或紫外线照射后，这种结合更加牢固。同时尼龙膜韧性强，操作较方便，对离子浓度要求不高，可重复用于杂文。但其杂交信号本底较硝酸纤维素滤膜高，这可通过增加预杂交
15、液中的非待异性封闭试剂用量的方法加以克服。,(2) Northern印迹杂交,Northern印迹杂交是指将RNA分子变性及电泳分离后、从电泳凝胶转移到固相支持物上进行核酸杂交的方法又称为Northern RNA印迹杂交等。 该法是在Southern印迹杂交基础上发展起来的，主要针对RNA分子的检测，基本步骤与Southern印迹杂交相似。但RNA分子与DNA分子有所不同，一般不能采用碱变性处理。 Northern杂交是研究基因表达的最严谨的方法之一，可以定量分析组织中某一特异mRNA的表达丰度，根据其迁移的位置也可判断基因分子大小。这一技术应用十分广泛，常用于基因表达调控、基因结构及功能、遗
16、传变异及病理研究。 注意：需在变性条件下电泳，防止RNA形成二级结构。,在RNA变性凝胶电泳中常用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺等。,(3) 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,如果只要检测克隆菌株、动植物细胞株或转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，则可采用斑点印迹杂交(dot blotting)或狭线印迹杂交(slot blotting)进行检测，它们是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种相似的快速检测特异核酸(DNA或RNA)分子的核酸杂交技术。,两种方法的基本原理和操作步骤相同，即通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。两者的区别仅在于呈现在杂交滤膜上的核酸样品分别为圆斑状和狭线状。,斑点杂交
