《丹参鉴定学专论》ppt课件

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1、2/28/2019,中药鉴定学专论,丹参分子生药研究,2/28/2019,一、丹参的传统鉴别方法与分子生药鉴别 二、丹参分子基因组的分析及构建 三、不同产地丹参分子生药基因组的分析 四、高质量的丹参叶片DNA的提取方法研究,2/28/2019,第一部分：丹参的传统鉴别方法与分子生药鉴别。,2/28/2019,1 丹参形态学鉴别,植物学特性鉴别传统方法大多根据丹参的形态方面对药材的真伪进行鉴别。 丹参为多年生草本,根砖红色,茎高4080 cm,多分枝,被长柔毛。叶常为奇数羽状复叶。叶柄长17 cm,小叶37,顶端小叶较大。小叶卵形或椭圆状卵形。长1. 58 cm,宽0. 85cm,先端钝,边缘具

2、圆锯齿,两面被柔毛,下面较密,花序顶生或腋生轮伞花序有花6至多花,组成假总状花序,密被腺毛及长柔毛;小苞片披针形;花萼钟状,长11. 3 cm,先端二唇形,萼筒喉部密被白色柔毛;花冠蓝紫色,二唇形,长22. 7 cm,花冠筒外伸,弯曲,上长达2 cm,筒内有毛环;雄蕊2,药隔长,花丝短,上臂药室发育, 2下臂的药室不育且联合;小坚果4,椭圆形,花期58月,果期89月。,2/28/2019,丹参形态,2/28/2019,丹参药材根部性状,丹参药材根部性状鉴别丹参及其亲缘种类的药用植物甚多,以根部特征区别各类丹参也是沿用很久的经典方法。丹参根的特征为:丹参多为带根茎的根,根茎粗短,有茎基残余,下着

3、生多数细长的根。根呈圆柱形,稍弯曲,表面呈砖红色, 粗糙,具多数纵沟或皱纹,有须根痕,外部栓皮常鳞片状剥落,皮层有时开裂,长822 cm,直径512 mm,质坚脆,易折断,断面不平,疏松有裂隙,皮部棕渴色或砖红色,韧皮部狭。形成层明显,淡棕色,木质部导管束灰黄色或黄白色,放射状排列。气微, 味微苦、涩,以条粗壮、色紫红者为佳。,2/28/2019,丹参药材根部形态,2/28/2019,水试鉴别法：,用水浸泡丹参根的方法对丹参进行鉴别,正品丹参根浸泡后的溶液无色,药材稍膨胀,颜色稍微变浅。伪品丹参溶液显红色药材变为淡红色。 水浸后续断会被染成红色,粉末中有草酸钙簇晶;丹参水浸不染成红色,粉末中无

4、草酸钙簇晶,但有石细胞及红棕色物为丹参。从而将两者进行区分。,2/28/2019,显微结构鉴别,根的横切面显微结构鉴别 根粉末的显微结构鉴别 花粉形态学特征对丹参及同属药用植物的鉴别,2/28/2019,根的横切面显微结构鉴别,根据丹参横切面显微结构特征与紫丹参进行区分,丹参(Salvia miltiorrhizaBge. )木栓层37列,木栓细胞长方形,切向延长,壁非木化或微木化;外侧有时可见落皮层。皮层窄,纤维单个散在或26个成群,孔沟放射状,层纹细密。韧皮部较窄,由筛管群和薄壁细胞组成。形成层明显成环。木质部宽广, 412 mm呈放射状排列。有些相邻的束在内侧合并,导管类圆形或多角形,有

5、的沿径向延长,直径1565 mm,单个散在或212个成群,径向排列或切向排列;木纤维发达,多成群分布于大导管周围;有的本质部束内有12群木化薄壁细胞;木射线宽广,射线细胞多木质化增厚。紫丹参根茎表皮细胞1列,内含紫红色物质;皮质薄壁细胞有的具纹孔;髓部薄壁细胞壁呈连珠状增厚或稍增厚,具纹孔。根本质部束常较小,导管也少。,2/28/2019,根粉末的显微结构鉴别,丹参粉末呈红棕色。木栓细胞黄棕色,表面观呈类方形或多角形,壁稍厚,胞腔内常含红棕色色素,色素溶解后,断面观细胞类长方形,排列较整齐。木纤维多成束,长梭形,纹孔斜裂缝状或十字状,孔沟稀。导管主要为网纹和具斜纹孔导管。石细胞呈类圆形、类三角

6、形、类梭形、类长方形或不规则形,也有延长呈纤维状,有的胞腔内含棕色。,2/28/2019,花粉形态学特征对丹参及同属药用植物的鉴别,一定的植物具有一定形态的花粉,因此花粉形态研究也是植物分类鉴别的依据之一。 丹参的花粉以外壁较薄、纹饰网眼较浅、网脊较粗、沟较宽、沟底具颗粒而区别于其他种。,2/28/2019,理化学方法鉴别,根据丹参所含的化学成分进行鉴别经过大量分析研究说明丹参所含化学成分中二萜醌成分与系统发育有密切关系,二萜醌类化合物组成的不同可以作为种类鉴别的依据,根据二萜醌成分含量的多少对丹参组作丹参的药用植物的亲缘关系进行划分。,2/28/2019,薄层色谱鉴别,采用薄层色谱定性鉴别的

7、方法比较后指出在同一展开系统的条件下,无论是野生还是栽培品种,丹参的一些主要成分相同,以此可以作为识别丹参药材真伪的参考依据。,2/28/2019,紫外吸收光谱鉴别,丹参在253, 277 nm两处有吸收特征峰,而甘西鼠尾在264,248, 218, 203 nm 4处有吸收特征峰。作丹参使用的药材紫外吸收光谱的范围不同,据此可以对两者进行鉴别。丹参粉末处理后置紫外灯(365nm)下现察显亮蓝灰色荧光。,2/28/2019,指纹图谱鉴别(HPLC法),具有色谱稳定性好、柱效高、应用范围广等特点,是中药指纹图谱研究中常用的手段。对丹参等几种中药指纹图谱与代谢指纹图谱研究的结果,指出不同产地的药材

8、在指纹图谱上存在较大差异。,2/28/2019,分子生物学鉴别方法,1 RAPD鉴别法：随机扩增的多态性DNA(RAPD)技术已经被广泛应用于物种鉴别。 2 DNA遗传标记技术随着分子生物学和基因工程技术的日趋成熟,从遗传DNA分子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定已成为可能。DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点,且不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响,已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景,并保持强劲的发展势。,2/28/2019,第二部分 丹参分子基因组的分析及构建,2/28/2019,1丹参主要居群DNA指纹图谱的建立 2丹参EST序列中SSR信息的分析及建立

9、,2/28/2019,丹参主要居群DNA指纹图谱的建立,基因组DNA的提取 编号 名称 来源 花颜色 Al 大叶丹参 四川中江 紫色 A2 商洛丹参 陕西商洛 紫色 A3 首县紫花丹参 山东芭县 紫色 A4 四倍体丹参 中国药科大学 紫色 A5 芭县白花丹参 山东芭县 紫色 A6 北京丹参 中国中医药研究院 紫色 A7 毫州丹参 安徽亳州 紫色 A8 丙城丹参 山西茵城 紫色 A9 江苏丹参 江苏射阳 紫色 A10 小叶丹参 四川中江 紫色 A11 安国丹参 河北安国 紫色 A12 甘西鼠尾草 甘肃 紫色 A13 一串红 陕西省杂交油菜研究中心 红色 A14 油菜 陕西省杂交油菜研究中心 黄色

10、 A15 小麦 陕西省杂交油菜研究中心 注:Al一Al，为各居群编号，以下同。,2/28/2019,RAPD一PCR扩增反应体系及扩增程序的优化,别设计M扩+、Taq酶、模板DNA的浓度及退火温度等单因子试验，同时保持扩增体系的其它成分浓度及扩增程序其它环节不变，以优化、确证适宜的M扩+、Taq酶、模板DNA的浓度及退火温度。,2/28/2019,鉴别丹参与其近缘和远缘植物的特征引物及其DNA指纹图谱,引物s2035、s222扩增结果不仅稳定、条带明亮，而且采用引物s2035、s232建立的指纹图谱丹参主产区的n个居群丹参的PCR扩增带型几乎相同(1一n泳道)，其中有200一1100bp的七条

11、共同的特异条带，即图6的条带Cl、CZ、C3、 C4、图7的CS、C6、C7，各丹参居群完全相同。,2/28/2019,结果验证：结果验证显示，PCR扩增重复性较好，取样合理，能够代表各居群。,2/28/2019,丹参EST序列中SSR信息的分析及建立,丹参EST序列中SSR信息的分析 微卫星（Microsatellite）又称简单重复序列(Simplesequence repeat)，指的是基因组中由 16 个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段 DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在 200bp 以下SsR 分子标记具有数量丰富，多性高，多等位基因，共显性，重复性高等优点。根据建

12、立 SSR 标记的序列性质不同可分为基因组 SSR （Genomic SSR,gSSR） 和表达序列标签 SSR（Expressed sequence tag SSR，EST-SSR）。EST 及表达序列标签是通过从 cDNA 文库中随机挑选的克隆进行大规模测序所获得的 5或 3端序列，长度一般在 150500bp。,2/28/2019,丹参 EST-SSR 引物情况表,引物编号 重复基元 GeneBank EST 编号 预期产物bp 引物序列 退火温度（）,SSR001 (TACA)5 CV172410 241 GAGGCTACTTCGTGGAGG 52.3 GAAACTAAAGCAACAA

13、ACCC 52.1,SSR002 (CA)16 CV172134 176 CCGTGGTGTTCCCTCTTT 55 TGCCGATTCTAACCTGTATG 53.7 SSR003 (CT)10 CV171877 137 AGAGGCTGCTGCTTCATT 52.7 TCAAGTCATAGGCGTGGC 54.5 SSR004 (AAC)6 CV171649 222 AGGCAGACAGACCTCATA 46.7 CTTCCCACCAAATAACTC 46.8 SSR005 (GTG)6 CV171565 153 CTCAGCACCTACTACCACAT 49.6 CTTATCCCAACA

14、CTTCTTCT 48.5 SSR006 (ATC)5 CV171563 155 AAACAGAGCGACGAAGCAG 56.2,2/28/2019,ACCACCATCACTCAAGACG 56.4,SSR007 (CTT)11 FE537066 165 CTCCGCTTCGCTCCTCTT 57.7 TGCTCGCTTCGTCGTCTT 57.2 SSR008 (GCT)6 FE536370 181 AGGTTACTACCGATGAAGCAG 54.1 AGTTGAGTGGTGATGGAAGAT 53.2 SSR009 (AAG)6 FE536230 145 GACTTTGGATGCCTGCTC 52.9 GACGCCGCTACTTTCTAT 50.2 SSR010 (TATGC)5 FE536872 136 AATAAGGCAATACAGGGTC 49.2 CTTTACACGCATAACACG 47.4 SSR011 (TC)18 FE536561 162 AACTTGGCAATGTTCGCTAT