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1、4、动物细胞与组织培养,4.1 动物细胞特点,无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢 需氧量少，对搅拌敏感 聚集体形成 原代细胞培养50代即开始退化,4.2 动物细胞培养定义,动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 是动物细胞工程的基础。,类型,1. 细胞培养 ； 2. 组织培养； 3 器官培养,4.3 发展历史,1885年W Roux 鸡胚神经板 1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞 A Carrel 无菌技术 1951 W Earle 培养基 。,4.4 生长特
2、性,贴附生长型 如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞 上皮样、成纤维样、无定形 单层、汇合 悬浮生长型细胞 如血液白细胞，淋巴组织细胞等,Figure 4-2 The fibroblast. (A) Phase-contrast micrograph of fibroblasts in culture. (B) Drawings of a living fibroblastlike cell in the transparent tail of a tadpole, showing the changes in its shape and position on successive
3、 days. Note that while fibroblasts flatten out in culture, they can have more complex, process-bearing morphologies in tissues. (A, courtesy of Daniel Zicha; B, redrawn from E. Clark, Am. J. Anat. 13:351-379, 1912.),常用术语,Cell, tissue & organ culture 贴壁依赖性、汇合 原/初代培养Primary culture 传代 细胞系（有限、无限/连续）已建成
4、的 二倍体、转化 细胞株（有限、无限/连续） 克隆 接触抑制,4.5 体外培养细胞基本技术,体外培养特点 体外培养工具 体外培养条件 体外细胞生长增殖过程 培养方法 大规模培养技术,4.5.1 体外培养特点,营养条件苛刻 适应性差, 敏感 培养时间长，易污染,Animal cells are more difficult to culture than microorganisms because they require many more nutrients and typically grow only when attached to specially coated surfaces
5、. Despite these difficulties, various types of animal cells, including both undifferentiated and differentiated ones, can be cultured successfully.,4.5.2 体外培养工具,空心纤维 微球,Cells/tissues grown in culture long period of time BASIC STERILE TECHNIQUE Work environment and surface Plasticware and glassware H
6、andling techniques Sterilization of solutions for maintenance growth or treatment,WORK ENVIRONMENT AND SURFACE Laminar flow hood Relatively enclosed space Little traffic flowing past work space Confined space can be easily cleaned and maintained Must have annual checkup of HEPA filters Should have i
7、nternal outlets for electricity, vacuum and gas Frequently outfitted with UV light Prevent contamination by daily scrub with 70% ethanol Use closed flask attached to vacuum for spent medium Separate sterile room All incoming air circulated through HEPA filters,PLASTICWARE AND GLASSWARE Pipettes, bot
8、tles, flasks, petri dishes Plastic - better attachment and cell growth of monolayer cell culture - more expensive than reusable glass - suitable for storage at 4C Glass - Can withstand temperatures 0C use for maintaining frozen stocks - Steam sterilize by autoclaving * relies on steam pressure and h
9、igh heat * use fast-dry cycle to dry condensate * use “wet” cycle for salt solutions toprevent evaporation * loosely place caps on bottles,4.5.3 体外培养条件,温度，37度 pH：7.2-7.4 气体，氧，二氧化碳，氮气 营养条件（天然/合成培养基） 需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供 低/无血清培养基 贴壁因子,生长因子多为肽激素，有胰岛素、表皮生长因素（EGF）、成纤细胞生长因素（fibrob
10、last gfowth factor，FGF）、血小板来源增殖因素（plateletderivedgrowth factor，PDGF）以及生长激素释放抑制因子（somatostatinSRIH）,Rich Media Are Required for Culture of Animal Cells,Nine amino acids, referred to as the essential amino acids, cannot be synthesized by adult vertebrate animals and thus must be obtained from their di
11、et. Animal cells grown in culture also must be supplied with these nine amino acids, namely, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, and valine. addition, most cultured cells require cysteine, glutamine, and tyrosine. The other essential components o
12、f a medium for culturing animal cells are vitamins, which the cells cannot make at all or in adequate amounts; various salts; glucose; and serum, the noncellular part of the blood,Most Cultured Animal Cells Grow Only on Special Solid Surfaces,The extracellular matrices in various animal tissues cons
13、ist of several common components: fibrous collagen proteins; hyaluronan (or hyaluronic acid), a large mucopolysaccharide; and covalently linked polysaccharides and proteins in the form of proteoglycans (mostly carbohydrate) and glycoproteins (mostly protein).,4.5.4 体外细胞生长增殖过程,原代培养期 传代培养期 衰退期,细胞系建立与鉴
14、定,基本概念 细胞系档案的有关说明 来源 生物学特性 培养条件和方法 鉴定纯度、稳定性、细胞学特征、污染检查,4.5.5 培养方法,悬滴 旋转管 灌注小室 培养瓶 培养板,细胞克隆,克隆形成率 技术 稀释铺板法 饲养层法 琼脂法 分离技术克隆化环、辐射、挑选法,细胞周期同步化,4.5.6 大规模培养技术,悬液培养，使用微载体技术 多孔微载体，不仅适合贴壁细胞，也适合悬浮细胞的固定化连续灌流培养 微囊（半透膜）化培养：海藻酸钠ALG/多聚赖氨酸PLL 中空纤维,4.5.7 动物细胞培养应用,1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等,Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺,D
15、MEM培养基,胎牛血清,其他成分,锥形瓶逐级放大培养,加碱（碳酸氢钠）,加糖（葡萄糖）,灌注培养液,微载体,5L种子罐培养,培养液,50L 生 物 反 应 器,接种狂犬 病毒,出液口,收获病毒,4.6. 组织工程,组织工程 组织培养 上皮组织 肌肉组织 神经组织,组织工程（Tissue Engineering）是近年来正在兴起的一门新兴学科，组织工程一词最早是由美国国家科学基金会1987年正式提出和确定的。它是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物的科学。,组
16、织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。共基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损病分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。,生物相容性好、可被人体降解吸收的组织工程支架材料称为细胞外基质（ECM），其功能是为细胞提供生存空间，使细胞获足够的营养物质，进行气体交换，并使细胞按预制形态的三维支架生长。在细胞和生物材料的复合体植入机体病损部位后，生物支架被降解吸收，但种植的细胞继续增殖繁殖，形成新的具有原来特殊功能和形态的相应组织器官。,种子细胞: 自体、同种异体、异种组织细胞等 细胞外基质（extracelluarmatrix,ECM） : 理想的ECM应具有以下特点：生物相容性好，在体
