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1、第十五章 真核生物基因的表达调控,In multicellular eukaryotes, differential regulation of gene expression is at the heart of cellular differentiation and function. The central question is,how an organism expressed a subset of genes in one cell type and a different subset of genes in another cell type.,真核生物与原核生物的调控差异
2、,真核生物基因的表达调控系统远比原核生物复杂。,真核基因组的复杂性 与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下: ,1、真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。,2、真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。,细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA； 真核生物则是一个结构基因转录生成一条
3、mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。,原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体 ；,原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列： 高度重复序列(high repetitive sequences),这类序列一般较短，长10-300bp，在哺乳类基因组中重复106次左
4、右，占基因组DNA序列总量的10-60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。,中度重复序列(moderate repetitive sequences)，这类序列序列多数长100-500bp，重复101-105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3-5105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成族重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。 单拷
5、贝序列(single copy sequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。,原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。,从上述可见：真核基因组比原核基因组复杂得多，至今人类对真核基因组的认识还很有限，现在国际上制订的人基因组研究计划(human gene p
6、roject)完成，绘出人全部基因的染色体定位图，测出人基因组109bp全部DNA序列后，搞清楚人全部基因的功能及其相互关系，特别是对了解基因表达调控的全部规律是有帮助的。,基因表达=基因转录+翻译 基因表达的调控: 生物体随时调整不同基因的表达状态,以适应环境、维持生长和发育需要。 主要是转录水平的调控 基因转录的调节： 1.DNA序列 2.调控蛋白 RNA聚合酶 3.DNA-蛋白质相互作用 活性的影响,第一节 真核生物中基因表达水平的分析,一、真核生物基因表达水平分析的方法,1、主要通过RNA驱动的动力学杂交实验来分析,待测RNA复杂度 待测RNA的Rot1/2 球蛋白mRNA复杂度 球蛋
7、白RNA的Rot1/2,=,2、丰余度,=,每细胞mRNA含量待测mRNA组分（%） 6 1023,待测组分的复杂度（相对分子质量）,第二节 染色质水平上的基因活化调节,一、染色质的疏松及活性染色质的特征,真核生物中基因的转录是以染色体结构的一系列重要的变化为前提的。,真核生物的重要特征之一是其核基因组DNA与蛋白质结合，形成以核小体为基本单位的染色质结构而存在于细胞核内。这种结构特征产生了真核生物基因转录前在染色体水平上独特的调控机制，这也就是说基因的转录是以染色质结构的一系列重要变化为前提的。对昆虫多线染色体的研究表明，基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定的
8、区域被解螺旋或变得很疏松。,The exact pattern of puffs differs in different types of cells (e.g., salivary gland vs. gut) differs with changing conditions in one type of cell. For example, giving the molting(蜕皮) hormone ecdysone（蜕皮激素） to an insect causes a predictable change in the puffing pattern.,These eight ph
9、otomicrographs show the changes in the puffing pattern of equivalent segments of chromosome 3 in Drosophila melanogaster over the course of some 20 hours of normal development.,如水蜡虫（Pseudococcus nipae）的异染色质化 水蜡虫（2n=10）在体细胞里来自父本的5条染色体依次被异染色质化，在精子形成时丢失，只保留来自母本的5条染色体。,另一方面，染色体中的异染色质化也是调节的重要因素,剂量补偿（dosa
10、ge conpensation） 雌性哺乳动物X染色体的失活,1.无汗性外胚层发育不良 2.三色猫 3. G-6-PDH,性连锁无汗腺外胚层发育异常基因在3代女性中出现体细胞嵌镶现象。受累者缺乏汗腺。体表无汗腺区域用蓝色表示 (引自Griffithset al1993),X-连锁的6-磷酸葡糖脱氧酶(G-6-PD)的测定也为莱昂假设提供了有力证据。女性虽然有二条X染色体，但其G-6-PD活性和男性的相同，表明其X染色体的总量有一半是失活的，这正好说明了剂量补偿作用。G-6-PD有A，B两种类型，二者之间只有一个氨基酸的差异，但电泳带的迁移率不同，A带比B带移动得快一点。它们分别由一对等位基因G
11、dA和GdB编码。GdA或GdB纯合的女人从各种组织取样进行电泳分析都只出现一条电泳带。GdA/GdB杂合的女人电泳的结果却会出A、B两条带。,用胰酶处理杂合体的皮肤细胞，使其分成单个细胞，然后进行克隆培养，每个克隆都来一个单细胞，再从各个克隆中取样进行电泳发现，每个克隆只出现一条电泳带或A，或B，而绝不出现二条带（图18-28）。表明细胞中虽有一对等位基因GdA/GdB的存在，但由于有一条X染色体失活，使其上的等位基因不能表达，所以只出现一条带。,三色猫（又叫做玳瑁猫）也是一个很好的例子。雌性的三色猫腹部的毛是白色的，背部和头部的皮毛由桔黄色和黑色斑组成。这种雌猫是一个X-连锁基因杂合体，X
12、-连锁的b基因控制橙色毛皮，其等位基因B是控制黑色的毛皮。带有b基因的X染体若失活，B基因表达，产生黑色毛斑，若带有B基因的X染色体若失活，b基因表达，则产生橙黄色毛斑。,二、 DNase的敏感性和基因表达,当一个基因处于转录活性状态时，含有这个基因的染色质区域对DNase（一种内切酶）降解的敏感性要比无转录活性区域高得多。这是由于此区域染色质的DNA蛋白质结构变得松散，DNase易于接触到DNA之故。,在鸡胚红细胞的核中，珠蛋白基因对DNase的降解是敏感的，而编码卵清蛋白的基因是不表达的，它对DNase的降解是不敏感的。,在母鸡输卵管细胞的核中，卵清蛋白的基因是具有转录活性的，而珠蛋白基因
13、是没有活性的。卵清蛋白基因的序列对DNase的降解要比珠蛋白基因的序列敏感得多。,鸡的珠蛋白和卵清蛋白基因。,染色质的变化可表现在对DNase的敏感性上,用DNAaseI来鉴 别基因的活性,不同组织中DNA的水解不一样,在成体的红细胞中，成体-球蛋白基因对DNAaseI的降解是高度敏感的，对胚胎-球蛋白基因是部分敏感的(可能是由于扩散效应)，但对卵清蛋白基因是不敏感的。,胚胎-球蛋白基因,成体-球蛋白基因,卵清蛋白基因,探针检验的不同结果,DNase敏感区的范围随着基因序列的不同而变化，从基因周围几个kb到两侧20kb大小不等。仔细分析具有转录活性基因周围的DNA区域，表明有一个中心区域存在，
14、称为超敏感区域（hypersensitive region）或超敏感位点（hypersensitive site），它对DNase是高敏感的。,由于对DNase的敏感性反映了染色质中DNA的活性，这些位点一般称为染色质中特殊DNA暴露区域。,一般在转录起始点附近，即5端启动子区域，少部分位于其他部位如转录单元的下游。,用DNA酶处理染色质可以得到酸溶性的DNA片段，而且处理时间越长，产生酸溶性DNA的比例越大，直到全部染色质都被降解掉。用特定基因的cDNA或mRNA作探针，可以测定某个基因被 DNA酶降解的情况。当总体 DNA的 10被降解成酸溶性物质时，50以上的活跃表达基因已优先降解了。,
15、说明基因转录时染色体具有解螺旋状况,这种容易被DNA酶影响的结构就被称为“活性染色质”。,超敏感位点是一段长200bp左右的DNA序列，这些区域是低甲基化区；并可能有局部解链的存在；不存在核小体结构或结构不同寻常，此区因DNA的裸露易和多种酶或特异的蛋白质结合，也就是说易于和反式作用因子结合。,染色质对DNase的敏感性与2种非组蛋白有关，那就是HMG14和HMG17，活化染色质中每10个核小体就结合一个HMG分子。,当从红细胞中提取出这两种蛋白时，珠蛋白基因不再对DNase出现敏感，当将这两种蛋白重新加入到此系统中，敏感性又可得到恢复。,超敏感位点建立于转录起始之前，转录的诱导物除去后，超敏
16、感位点仍然存在，但转录却很快停止，说明超敏感位点的存在是转录起始的必要条件，但不是充分条件。,HMG14 and HMG17 位于细胞核的不同位置。两种蛋白质双标记后在共聚交显微镜下的图象HMG14 (red) and HMG17 (green).,HMG蛋白的C端含活性氨基酸，可与核小体核心组蛋白的碱性区域相结合。HMG蛋白的N端1/3的区域氨基酸序列与H1和H5的C端十分相似。而HMG在核小体上位置与H1相近，HMG和组蛋白相互作用。可以竞争性取代H1和H5 ，核小体缺乏H1和H5将使染色质变得松散，成为具有转录活性的状态。,除HMG以外可能还有别的因素会影响到染色质的活性，当把上述两种HMG加到鸡脑细胞的染色质中，其中珠蛋白基因所在区域并不表现出对DNase的敏感，表明红细胞和脑细胞还存在其他因子的差异，这些因子在盐抽提后仍留在染色质中，它们决定了红细胞珠蛋白基因区域在HMG14和HMG17存在时对DNase敏感。,活性染色质部分的染色体蛋
