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1、,第三章：基因工程,能发光的水母,请您欣赏,能否能否让热带鱼也能发光?,设想,不能发光的热带斑马鱼,生命科学概论-基因工程与酶,能发荧光的热带斑马鱼,普通热带斑马鱼是不发荧光的,请您欣赏,超级小鼠与超级鱼,能产生人胰岛素的大肠杆菌,请您欣赏,生命科学概论-基因工程与酶,基因“嫁接”,生命科学概论-基因工程与酶,一、基因工程(gene engineering) 又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因重组,生物体外,DNA分子水平,定向地改造生物的遗传性状，获得人类所
2、需要的品种。,生命科学概论-基因工程与酶,培育转基因大肠杆菌的简要过程：,你认为上述培育转基因大肠杆菌的关键步骤有哪些？,普通大肠杆菌 (不能分泌胰岛素),生命科学概论-基因工程与酶,培育转基因大肠杆菌的关键步骤：,生命科学概论-基因工程与酶,1、 基因的“剪刀”限制性核酸内切酶 专一性： 识别特定核苷酸 序列，在特定的切点切DNA， 具特异性。并裂解磷酸二酯 键，产生两个黏性末端。,二、基因操作的工具,生命科学概论-基因工程与酶,黏性末端,例：大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。,EcoR,生命科学概论-基因工程与酶,被同一种限制酶切断的几个DNA是
3、否具有相同的黏性末端？,思考:,生命科学概论-基因工程与酶,2、基因的“针线” DNA连接酶 连接酶的作用： 与“基因剪刀”作用相反，将互补配对的两个黏性末端连接起来，生成磷酸二酯键，使之成为一个完整的DNA分子。（连接DNA阶梯的断口的“扶手”而非“踏板”） DNA连接酶的作用过程：,生命科学概论-基因工程与酶,基因的针线：DNA连接酶,生命科学概论-基因工程与酶,观看视频： DNA重组的“剪刀与针线”,生命科学概论-基因工程与酶,3、基因的运输工具运载体,常用的运载体： 质粒、噬菌体和动植物病毒等，都有侵染或者进入宿主细胞的能力！,标记基因，便于进行检测。,质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物
4、中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子.,生命科学概论-基因工程与酶,作为运载体必须具备哪些条件？,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。 3）具有某些标记基因，便于进行筛选。 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,1、细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子； 2、质粒的存在对宿主细胞无影响； 3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,质粒可作为有何特点？,生命科学概论-基因工程与酶,四个基本步骤：,1）提取目的基因 2）目的基因与运载体结合 3）将目的基因导入受体细胞 4）目的基因的检测和表达,三、基因工
5、程的操作步骤,生命科学概论-基因工程与酶,从细胞中分离出DNA,从大肠杆菌中提取质粒,提取目的基因,目的基因与运载体结合,DNA连 接酶,目的基因导入受体细胞,目的基因的表达与检测,基因工程操作的基本步骤,生命科学概论-基因工程与酶,目的基因的提取方法,直接分离基因 人工合成基因,反转录法 根据已知的氨基酸序列合成DNA,：鸟枪法、PCR,生命科学概论-基因工程与酶,直接分离基因鸟枪法,将供体细胞中的DNA用限制酶切割为许多片段，再用运载体将这些片段都运载到不同的受体细胞中去，让这些DNA片段在受体细胞中扩增。从中找出含有目的基因细胞，并将含有目的基因的DNA片段分离出来。 该法最大的缺点是带
6、有很大的盲目性，工作量大。一般不适用于真核细胞的基因。,生命科学概论-基因工程与酶, PCR,生命科学概论-基因工程与酶,多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction),无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。,总体积 50-100 l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子
7、模板 Taq酶 DNA聚合酶,生命科学概论-基因工程与酶,生命科学概论-基因工程与酶,变性：使双链DNA解链为单链（94，20-30s） 退火：降低温度，使引物得以与单链DNA结合，退火温度由引物长度和序列决定（一般40-60） 延伸：72反应，合成两条引物界定的DNA序列 循环：循环以上步骤，DNA加倍合成,PCR技术的基本过程,生命科学概论-基因工程与酶,短时、快速扩增目标DNA的方法，使基因数目放大了数百万倍以上,生命科学概论-基因工程与酶,观看视频： PCRDNA克隆技术,PCR技术总结： 特异性扩增 短时、大量DNA片段的获取,PCR目标产物的验证：琼脂糖凝胶电泳,DNA分子在高于等
8、电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动 琼脂糖凝胶具有网络结构，其分子筛作用，物质分子通过时会受到阻力，大分子DNA在涌动时受到的阻力大，因此可根据条带的位置判断分子的大小,生命科学概论-基因工程与酶,生命科学概论-基因工程与酶,DNA Maker,PCR产物,目标条带约1700bp,生物样品（血液、精液、唾液）,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术,生命科学概论-基因工程与酶,（3）人工合成基因法,DNA合成仪,直接合成法：
9、根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。,反转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。,生命科学概论-基因工程与酶,用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组DNA分子。,目的基因与运载体结合,目的基因与运载体结合的结果可能有三种情况：目的基因与目的基因结合，质粒与质粒结合，目的基因与质粒结合。所以需要筛选。,作用：将外源基因送入 受体细胞,生命科学概论-基因
10、工程与酶,常用的受体细胞：,目的基因导入受体细胞,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，主要有氯化钙-热激法和电击法。,导入方式：,生命科学概论-基因工程与酶,氯化钙-热激法导入DNA载体：,CaCl2处理细菌可提高细菌吸收周围环境中DNA分子,这种状态的细菌被称为感受态细菌 冰冷条件下，CaCl2能使细菌细胞膨胀，细胞壁通透性增强；DNA以Ca-DNA复合体的形式结合于细菌细胞表面 突然增加温度（42，90s）然后再突然降低温度（冰浴），细胞表面的DNA分子即可被细胞吸收,生命科学概论-基因工程与酶,电击法导入DNA载体：,细胞在缓冲液中
11、悬浮, 施加电场后则会使细胞膜产生了横跨膜的电位差, 使细胞膜出现电穿孔,在一个临界的电场强度上,决定了细胞膜的破裂和气孔的形成,使遗传基因转移到细胞中去,如果电场强度和脉冲宽度适当的话,场强移去后,细胞破裂和形成的孔可以愈合。,生命科学概论-基因工程与酶,大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,目的基因的检测和表达,检测：通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入。,表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基
12、因是否表达。,生命科学概论-基因工程与酶,生命科学概论-基因工程与酶,观看视频： 基因工程/重组技术整体过程回顾,总结： 所需的原料与工具 技术流程 原理基础（上一节课的中心法则）,转基因抗虫棉花,转入苏云金杆菌的一个抗虫基因，是中国目前最主要的转基因作物,四、 基因工程的应用,1、基因工程与作物育种,生命科学概论-基因工程与酶,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯,不会引起过敏的转基因大豆,生命科学概论-基因工程与酶,运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。,乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷),生长快、
13、耐不良环境、肉质好的转基因鱼(中国),生命科学概论-基因工程与酶,导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠,导入人基因具特殊用途的猪和小鼠,超级动物,特殊动物,生命科学概论-基因工程与酶,我国生产的部分基因 工程疫苗和药物, 基因工程药品的生产,许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。,微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。,2、基因工程在医学上的应用,生命科学概论-基因工程与酶,胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-
14、5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!,生命科学概论-基因工程与酶,通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取204mg干扰素。,干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。,基因工程人干扰素-2b（安达芬） ，是我国第一个全国产业化基因工程。安达芬具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治
15、疗的主要药物。,生命科学概论-基因工程与酶,其它基因工程药物,人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。,人造血液及其生产,生命科学概论-基因工程与酶, 基因诊断与基因治疗,诊断：用放射性同位素等标记的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。,生命科学概论-基因工程与酶,基因诊断DNA探针,概念：是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测，是基因诊断最基本的技术之一。 条件：（1）必须是单链； （2）带有容易被检
16、测出来的标记物。 原理：DNA分子杂交（碱基互补配对）,生命科学概论-基因工程与酶,基因诊断生物芯片,从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱；从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱 通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。 基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。,生命科学概论-基因工程与酶,基因治疗用正常的基因取代或修补病人细胞中有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的,生命科学概论-基因工程与酶,1990年9月14日，安德森对一例患ADA缺乏症的4岁女孩进行基因治疗。这个4岁女孩由于遗传基因有缺陷，自身不能生产ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在无菌的隔离帐里。他们将这个女孩的白血球进行基因改造，使有缺陷的基因被健康的基因替代，然后把含正常白血球的溶液输入她左臂的一条
