《酶与细胞固定化》ppt课件

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1、第六章 酶、细胞、原生质体固定化,游离酶的缺点：,(1) 酶的催化效率不够高,(2) 酶的稳定性较差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。,(4)产物的分离纯化较困难 ，酶在催化反应结束后与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一定的困难。,(3)酶使用后通常不能回收，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产，从而导致酶的使用效率低，产品成本高。,第一节 酶的固定化 第二节 微生物、植物和动物细胞固定化 第三节 原生质体固定化,第一节 酶的固定化,一、固定化酶的优缺点 二、酶的固定化方法 三、固定化酶性质 四、固定化酶的应用,酶的固定化：借助各种物理或化学方法，将酶固定于水

2、不溶性载体上的过程。,固定化酶(immobilized enzyme) ：固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。 （固定化酶又叫水不溶性酶）,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶 （固定化酶）,固定化技术,固定化酶的优点,一、固定化酶的优缺点,固定化酶缺点,缺 点,比较适应水溶性底物和小分子底物。,固定化成本高。,酶固定化时酶的活力有所损失。,二、酶的固定化方法,1.吸附法,2.包埋法,3.共价偶联法,4.交联法,固定化方法,吸附法,结合法,交联法,包埋法,网格型,微囊型,离子键结合法,物理 吸附法,共价键结合法,1、吸附法,（1）定义：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌

3、体吸附在其表面上。,物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、大孔合成树脂等。,优点：酶的活性中心不易被破坏，酶活力损失小。 缺点：结合力弱，易解吸附。,（3）制备方法：,a. 静态法 (statia procedure) ： 没有搅拌、振摇情况下，将载体直接加入酶溶液，通过自然吸附、解吸、再吸附等过程、制备固定化酶。 该法操作简便，但效率低，耗时，吸附量小且不均匀。 b.电沉积法 (electrodeposition procedure) ： 在酶溶液中放置两个电极，在电极邻近加入载体，接

4、通电源，酶移向电极并沉积到载体表面，以制备固定化酶。 该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注意酶在电场中的稳定性。,c. 混和振摇装载法 (mixing or shaking bath loading) ： 是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅拌下或摇床连续振摇下完成固定化。 该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率，既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。 d. 反应器装载法(reactor loading process)： 这是工业上常用方法，它将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶液，然后通过循环流振动方式使酶和载体达到充分混和。,(1) 定义：

5、将酶分子包埋在各种多孔载体中，制成一定形状的固定化酶的技术，主要用于水溶性小分子底物转化反应。,2、包埋法：(entrapment),(2)包埋法的类型：酶被包埋成网格型称为凝胶包埋法；酶被包埋成微胶囊型称为微胶囊包埋法。 包埋过程不发生反应,凝胶包埋法（网格型）：将酶包埋在凝胶内部的微孔中。 微胶囊包埋法（微囊型）：将酶包埋在高分子半透膜中。,a. 凝胶包埋：,使用的多孔载体及其特点,海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至 海藻酸钠溶液E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶包埋法： 滴至 角叉菜胶E (or cell) KCl 溶液中 IE (or IC) 聚丙烯酰胺凝

6、胶包埋法： 过硫酸钾 Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) 二甲氨基丙腈,b. 微囊型包埋(microencapsulation)：又称半透膜包埋法：,将酶包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微米几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球内，制成固定化酶。 常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜 制备方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性剂乳化液包埋法。 分述如下：,界面沉降法： 利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。 例： 以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先将酶的水溶液在含有硝酸纤维素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝

7、酸纤维素在酶液液滴周围凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉胶囊。,界面聚合法： 将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微囊中。 例：以尼龙膜包埋酶时，将酶液及亲水性单体（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，将疏水性单体（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等与水混溶的有机溶剂。然后，将这两种互不相溶的液体混和在一起。加入乳化剂乳化，使酶液分散成小液滴。此时，亲水性的已二胺与疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，将酶包埋在小球内。再加Tween20，使乳化破坏，用离心分离即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。,表面活性剂乳化液膜法： 在酶的水溶液中添加表面活性剂

8、，使之乳化形成液膜达到包埋的目的。该法不含化学反应，简便，而且固定化是可逆的，但有渗漏的可能性。,脂质体包埋： 将酶包埋于脂质体(Liposome)中的方法。脂质体是指具有脂双层结构和一定包囊空间的微球体。 脂质体包埋的特点： 具有一定的机械性能，能定向将酶等被包裹物携带到体内特定部位，然后将被包裹物质释放。因此，其在药物应用方面受到重视。,与凝胶包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1）固定化酶颗粒小。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。,包埋法是目前应用最多的一种较理

9、想的方法，与其它固定化方法相比： 优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。 缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。,1）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素,3.结合法,载体通过共价键或离子键与酶结合的固定化方法。,1）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素,优缺点： 催化效率损失小； 结合力弱，改变pH和离子强度可使酶脱落。,借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。,2）共价结合法,A.

10、 载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙,亲水性好， 有一定机械强度,2）偶联方法：,芳香氨基 羟基 羟甲基 氨基,载体上的功能基团,酶分子上的非必需侧链基团,游离氨基 胍基 酚羟基 巯基 咪唑基 羟基,重氮法 叠氮法 卤化氢法 烷化法 缩合法,常用的偶联反应, 重氮法： 这是带芳香氨基载体的主要反应，即载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再在温和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、咪唑基或氨基直接进行偶联。（见示意图）,载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的

11、酚基或咪唑基发生偶联反应值得固定化酶。 ROCH2C6H4N+=N+E ROCH2C6H4N NE,亚硝酸可由亚硝酸钠和盐酸反应生成： NaNO2+HCl HNO2+NaCl, 叠氮法： 含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。以羧甲基纤维素为例，先将羧甲基纤维素甲酯化，再与肼反应生成羧甲基纤维素的酰肼衍生物，然后再与亚硝酸反应得到叠氮化合物，这种产物能在低温、pH 7.58.5的情况下和酶的氨基直接偶联。叠氮衍生物也能和羟基、酚羟基或巯基反应。,ROCH2COOH+CH3OH ROCH2COOCH2 +H2O CMC CMC甲酯,R-O-CH2-COO-CH2 +NH2-NH2 R

12、-O-CH2-CO-NH-NH2+CH3OH CMC甲酯 肼 CMC酰肼衍生物,ROCH2CONHNH2+HNO2 ROCH2CON3+2H2O,ROCH2CON3 +H2NE ROCH2CONHE ROCH2CON3 +HOE ROCH2COOE ROCH2CON3 +SHE ROCH2COSE, 溴化氰法(常用)： 带羟基的载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等常用的反应。在碱性条件下载体羟基和溴化氰反应生成极活泼的亚氨碳酸基，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共价偶联反应。, 烷基化法： 含羟基的载体也可在碱性条件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、酚羟基

13、或巯基等偶联。, 缩合法： 利用羰二亚胺的活化作用，使氨基与羧基直接偶联缩合成肽键的反应，适用于带羧基或氨基的载体。,优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。 缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。,4.交联法（crosslinking） 借助双功能试剂使酶分子之间、酶分子与惰性蛋白或酶分子与载体间发生交联，形成共价键连接来制备固定化酶的方法。 双功能试剂： 常用的是戊二醛,戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。,此法与共价偶联法利用的均是共价键。,在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳，为克服

14、这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上，或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定化酶“网”膜或“网”颗粒。这种方法又称为双重固定化法。,交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态（修饰）。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态（固定化）。,缺点： (1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。,优点： 制备简单、结合牢固、可以长时间使用。,酶和细胞固定化示意图,各种固定化方法的优缺点比较,各种固定化方法的优缺点比较,三、固定化酶的性质 酶分子经固相化后，从游离态变为结合态。酶分子处

15、在一个与游离态酶完全不同的微环境中，微环境的许多性质会影响酶原有的性质。,1. 活力：,大多数酶固定化后，酶活性下降。 原因：（1）构象改变；（2）空间位阻 （3）活性中心与载体结合,评价固定化酶的指标：,相对活力低于75%，没有实际应用价值。,2. 稳定性：,(2)固定化后半衰期增长，保存稳定性好。,影响原因： 固定化增加了酶活性构象的牢固程度，并且固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形。 抑制酶自身降解，酶与载体固定化后失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了其自身的降解过程。 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭，但是如果固定化触及到酶的活性部位或调节部位，也可能导致酶稳定性下降。,3.最适反应pH：,酶经固定化后，其作用的最适pH常会发生偏移，影响固定化酶最适pH的因素：,(1) 载体性质对最适pH影响： 带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移。 不带电荷载体 : 最适pH一般不改变。,(2) 产物性质对最适pH影响； 酶催化反应产物为酸性：最适pH向碱性偏移。 酶催化反应产物为碱性：最适pH 向酸性偏移。 酶催化反应产物为中性：最适pH