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1、 银杏总黄酮对肾缺血再灌注大鼠p-JNK表达的影响朱家军1，夏安周2，王妍妍2，张探2, 李娜2(1.灌云县人民医院，江苏灌云222200.徐州医学院，江苏徐州221004；)摘要 目的： 观察肾缺血再灌注损伤（IRI）后JNK活化的变化，并探讨银杏总黄酮（TFG）对其影响。方法： SD大鼠随机分为假手术组（Sham，n = 12)、缺血再灌注组（IR，n = 30）和银杏总黄酮处理组（TFG，n = 12）。采用夹闭双侧肾动静脉45 min然后松开动脉夹制备肾IRI模型。蛋白免疫印迹检测肾组织中p-JNK的表达，并用细胞凋亡原位末端标记（TUNEL法）检测肾小管上皮细胞凋亡。结果： IR组肾
2、组织中p-JNK的表达在再灌注10 min 开始升高，再灌注30 min 达到高峰，再灌注1h有所降低，再灌注24h再次升高，同时该时段有大量肾小管上皮细胞凋亡；给予TFG处理，再灌注30min p-JNK表达明显减弱，再灌注24h细胞凋亡明显减少。结论：TFG 防治肾IRI机制可能与抑制肾组织中JNK磷酸化的程度，减少肾小管上皮细胞凋亡有关。关键词 缺血再灌注；银杏总黄酮；c-Jun 氨基末端激酶；肾 Effect of total flavone of Gingko on phosphorylation of JNK in rats with renal ischemia-reperfus
3、ion injuryXIAAn-zhou1， ZHUJia-jun2 *， WANGYan-yan1，ZHANGTan1 ,LINa1 (1 Department of pharmacology , Xuzhou Medical college , Xuzhou 221002；2 Department of Anesthesiology, the Peoples Hospital of Guanyunxian , Jiangsu, Lianyungang 222004)Abstract：Objective To investigate the change of phosphorylation
4、 of JNK in renal ischemia reperfusion injury（IRI）and study the effect of total flavone of Gingko（TFG）on JNK activation. Methods Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operation group（Sham, n =12)，ischemia reperfusion groups（IR, n=30) and TFG groups（TFG, n=12). The modelswereestabli
5、shed through clamping bilateral renal arteries for 45 minand then reperfusion. Tubular cell apoptosis was confirmed by terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT)-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay；The phosphorylation of JNK were detected by Western blotting analysis. Results In th
6、e IR group, the levels of tubular cell apoptosis were significantly increased; activation of JNK was observed in the kidney as early as 10 min after reperfusion，reaching its peak at 30 min and declined at 1 h，but increasd at 24 h after reperfusion. pretreatment with TFG decreased significantly the l
7、evels of tubular cell apoptosis; it also decreased the phosphorylation level of JNK compared with that in the IR group. Conclusion The results showed that the mechanism of TFG to protect the renal IRI may be associated with decreasing the phosphorylation of JNK，and therefore inhibiting apoptosis of
8、tubular epithelial cells. Key words：ischemia-reperfusion; flavone of Gingko；c-Jun NH2-terminal kinases；kidney肾脏是发生缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury , IRI) 极为常见的器官之一，在肾脏手术、肾移植、失血或中毒性休克后微循环再通、体外震波碎石等治疗过程中均可发生不同程度IRI。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinases，JNK)信号通路作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protei
9、n kinase , MAPK)信号通路中重要一员，参与多种生理、病理过程。目前有研究表明，JNK信号通路在缺血再灌注损伤过程中尤其是细胞凋亡的过程中发挥着重要的调控作用1。银杏总黄酮（total flavonoid of Ginkgo，TFG）是银杏叶主要有效成分之一，具有扩血管、降血脂、抗炎、平喘和延缓细胞衰老等多种独特药理活性2，3，4。近年来研究还发现，TFG对心、脑IRI有保护作用5.6，但TFG对肾IRI是否具有保护作用，至今未见报道。本实验通过建立肾IRI模型，结合TUNEL染色法、蛋白免疫印迹等技术探讨TFG对肾IRI的保护作用以及其与抑制JNK激活的关系，旨在为TFG药效的拓
10、展研究提供实验依据。1材料和方法1.1 试剂TFG（南京泽朗医药科技有限公司）；血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；SDS-PAGE凝胶（碧云天生物技术研究所）；多克隆兔抗大鼠p-JNK抗体（cell signaling公司）；细胞凋亡检测试剂盒（北京中杉生物技术有限公司）及相应的辣根过氧化酶标记二抗(北京中山生物技术有限公司)。1.2 动物分组与药物处理雄性SD大鼠54只，体重200250g，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分成假手术组(Sham，n = 12)、缺血再灌注组(IR，n =30)、TFG处理组（TFG，n =12）。术前TFG处理组按
11、100mg kg-1 d-1灌胃，Sham和IR组给予等体积生理盐水灌胃，连续1周。1.3 模型建立及取材以戊巴比妥钠（45 mg kg-1）腹腔麻醉大鼠, 俯卧位固定，沿背部正中线逐层切开皮肤、肌肉，于脊柱旁双侧行肾区切口，暴露双侧肾脏，游离左、右肾蒂，玻璃分针小心分离出肾动静脉，夹闭左、右两侧肾动静脉45 min后松开动脉夹制备IRI模型，分别于再灌注0、10、30min及1、24h时相点处死动物留取样本。TFG处理组按同样的方法制备IRI模型，Sham组除不夹闭肾动静脉外，其余处理同IR组。TFG组与Sham组分别于再灌注30min及24h处死动物取样。各时相点均取6只动物，取肾后，沿其
12、长轴切成薄片置于-70冻存备用，另取再灌注24h时相点一部分肾组织置入4%中性甲醛液中固定以制备石蜡切片。1.4 观察指标及方法1.4.1 TUNEL 法检测细胞凋亡 切片常规脱蜡、梯度酒精入水；新鲜配制3% H2O2消除内源性过氧化酶，双蒸水洗涤 2min3次；加蛋白酶K37消化5 min，PBS洗2min3次；每张切片加TdT和DIG-dUTP各1L，置样本于湿盒中，37标记2 h，PBS冲洗2min3次；加封闭液 50L /片，室温30 min，甩掉液体不洗，加生物素化抗地高辛抗体，37反应60min，PBS洗2min3次；加链霉素-生物素-过氧化物酶，37 反应60 min，PBS洗5
13、 min4次；3, 3-二磷酸联苯胺 (DAB)显色。切片中细胞核出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。高倍镜下每张切片随机选取10个无重叠视野，计数凋亡阳性细胞，以凋亡指数（AI）反映各组凋亡的情况，凋亡指数( apoptosis index，A I) = 凋亡细胞数/肾小管细胞总数100%1.4.2 蛋白免疫印迹 取-70下保存的肾组织约100mg, 加预冷的蛋白裂解液0.25 ml，充分研碎匀浆，4 12 000 g离心2 min，取上清液按Lowry法测定蛋白浓度。取15l样品常规进行10%SDS-PAGE电泳，以恒流350mA，转膜80min；取出NC膜，Washing buffe
14、r洗膜2min2次，加入BSA封闭液封闭2小时；加入多克隆兔抗大鼠p-JNK抗体（1:1000），室温摇床2h，4过夜孵育，Washing buffer洗膜6min3次，洗膜后加山羊抗兔IgG二抗体（1:1000）于室温孵育2h，Washing buffer洗膜6 min3次；最后加入NBT/BCIP显色，所得显色条带经图象处理仪行激光扫描，Image J分析软件对图象进行光密度扫描，分析目的p-JNK与-肌动蛋白的条带灰度值。以-actin蛋白表达水平作为目的蛋白内参照，用目的蛋白条带灰度值与内参灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达含量。实验重复4次。1.5 统计学分析用SPSS13.0 软件
15、作统计学分析。计量资料以Mean SD表示, 组间比较用单因素方差分析, P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 IRI 后肾组织中p-JNK蛋白表达的动态变化 Western blotting 结果显示，p- JNK在各组均显示2个条带, 分别位于46 kD 的p-JNK1（下）和54kD的 p-JNK2（上） 处，表达均以p-JNK1为主。未灌注组大鼠肾组织仅有少量的JNK活化；IR组p-JNK表达强度有一定规律，再灌注10min 大鼠肾组织JNK磷酸化水平升高，高峰出现在再灌注30 min，再灌注1h段p-JNK表达减弱，到再灌注24h时相段p-JNK表达再次增强，呈双向变化。
16、各时相段p-JNK蛋白表达水平均高于未灌注组( P 0.05或0.01)，见图1。-actinp-JNKp-JNK2p-JNK10 min 10min 30min 1h 24h 图1 Western blotting 检测肾IRI后JNK活性的动态变化 与再灌注0 min比较：P 0.05，P 0.01 ； s , n=6Fig 1 Changes of JNK activation at different periods after IRI by Western blotting2.2 TFG 对IRI后大鼠肾组织JNK活化的影响 由于IRI后肾组织内p-JNK在再灌注30min表达最明显，故本研究选择此时相点观察TF
