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1、液相色谱基础知识,色谱的发明人,俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献,一、色谱起源,经典液相色谱,色谱法简介,色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学家1903年发现色谱的吸附原理，开创了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸于俄文的文献 1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography 50年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱 高效液相色谱法的广泛应用始于70年代,色谱分离的机理,色谱是一种分离技术 色谱分离是一个物理过程,流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的
2、溶质）,液相色谱分离机理,高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微粒作固定相，待测组分在柱内的两相之间进行高速分配和高效分离的柱液体色谱方法。 样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微小差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两相之间产生不同的相互作用力，从而导致柱上迁移速率的微小差异。 随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不断扩大，直至柱内出现明显不同的迁移距离，使最终达到组分完全分离。,什么是液相色谱,气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相,什么是高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种区别
3、于经典液相色谱；基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段,液相色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵输液,分离,检测,记录仪和积分仪-色谱工作站,进样阀,进样,HPLC的仪器配置,色谱泵（主机）,自动进样器,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂 流动相,高效液相色谱基本概念, 色谱峰或色谱谱带 基线噪音 基线漂移 检测限（敏感度） 色谱峰对称性 色谱定性参数 色谱柱效能参数,液相色谱图相关术语,色谱峰 Peak 色谱
4、柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离,液相色谱图相关术语,峰面积 Peak Area 峰与峰底之间的面积 标准偏差； Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 Leading Peak
5、 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰,液相色谱图相关术语,基线 Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线漂移 Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,液相色谱图相关术语,死时间，t0 Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tR Retention time
6、组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VR Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,液相色谱实验所需的基本参数,液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、粒径、长短 流动相流速 检测器参数：紫外检测波长或其他检测器相应参数 柱温度 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法， 亦称色谱条件,色谱图：HPLC图形结果 （Chromatogram）,色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，
7、其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。, 色谱峰,保留时间（分）,基线 ,峰高,峰宽,响应值,色谱峰或色谱谱带,流出曲线上的突起部分称为色谱峰 正常色谱峰为对称形正态分布曲线 不对称色谱峰有两种：前延峰和拖尾峰,色谱流出曲线图及相关参数,样品进入色谱柱，经流动相冲洗，由检测器测得的信号-洗脱时间曲线，即色谱图。,检测限（敏感度）,常用基线噪音的三倍表示： S/N=3 式中： N 为噪音（mV或mAU) S 为信号(mV或mAU),对称因子计算示意图,色谱峰的对称性对称因子： a. 拖尾因子 b. 不对称因子,峰对称因子计算公式,对称因子(fs)：,式中： fs=0.951.05为正常峰 fs0.95为前延峰 fs1.05为拖尾峰,色谱柱效能参数计算示意图,色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式： W s 方法 Wtan 16 切线法 Wh 5.54 半峰高 W3s 9 3s W4s 16 4s W5s 25 5s,理论板数(n)计算公式,或（通常用）：,若应用调整保留时间 tR计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数( n有效或 neff ),分离度(R）计算方法示意图,高效液相谱分离的基本方程式,影响分离度的因素很多，但可慨刮为三个基本项,(a)柱效项。(b)柱选择性项(c)柱容量因子项。即：,注意：保留时间和峰宽的变化,Rs与N、K及 的关系图示,
