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1、2010年版药典附录无菌检查和微生物 限度检查方法增修定内容,一：新增微生物限度检查法指导原则 四、药品微生物实验室规范指导原则 二：2010年版无菌检查法增修订内容 三：微生物限度检查增修定内容 四：新增微生物限度检查法指导原则 一、抑菌剂效力检查法指导原则 二、药品微生物检验替代方法验证指导原则 三、微生物限度检查法应用指导原则,一：药品微生物实验室规范指导原则,目的 该指导原则用于指导药品微生物检验实验室的质量控制。 药品微生物的检验的对象具特殊性； 活的生物、 分布不均匀、重现性差 必须使用经验证的检测方法并严格按照药品微生物实验室规范要求进行试验,影响试验结果的因素1人员2设施与环境
2、 3检验的标准与方法4设备 5测量的溯源性抽样7样品的处理 8检验结果准确性的控制9检验报告 药品微生物实验室规范包括以下几个方面 人员、培养基、菌种、实验室的布局和运行、设备、文件、实验记录、结果的判断等,人的要求,1：人是质量控制与管理的主体 2：2010年版无菌检查法增加了对进行无菌检查人员的要求：必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 3;考试上岗问题;检验人员经过考试（理论与操作考试），经过技术负责人批准取得上岗证方可从事药品微生物学检验,培训内容,1上岗前指导性培训：生物安全操作知识和消毒知识，卫生要求，洁净区的使用，保洁与检测等。 2上岗培训：各种有关微生物的操作技术（无
3、菌，微生物限度，效价），与各种检验标准知识，设施，设备的使用 3继续教育提高培训：新知识，新仪器新技术的使用，国际国内先进的微生物学检验专业知识。 4质量观念的培训：实验室的质量目标，相关计量知识的学习,培养基,培养基是微生物试验的基础，直接影 响微生物试验结果。适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保证。 该指导原则对培养基的制备、储存、灭菌及质量控制进行了指导。,培养基必须具备五个条件,: 1含有细菌生长所需的物质：如：水分、养分（氮源、碳源、矿物质） 2适宜的酸碱性：多数为pH7.2-7.6，有的为pH5.6-6.8（最常用的溶剂为纯化水特殊情况下用去离子水或者蒸
4、馏水） 3不含抑制细菌生长的物质 4 均质透明：便于观察细菌生长性状和引起培养基的变化 5严格灭菌，保证无菌。（按生产者提供或者使用者验证的参数灭菌）,菌 种,实验室菌种的处理和保藏的程序应标准化， 使尽可能减少菌种污染和生长特性的改变。 按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结果一致性的重要保证。,该指导原则对菌种的来源、菌种保藏、 菌种的传代和使用、菌种的管理进行了详细的说明和指导。,菌种代号的意义,国内药品微生物检验所用的菌种代号是 CMCC（ F） 或 CMCC（ B） CMCC 中国医学菌种保藏中心 B 代表细菌,F 代表真菌 。 大肠杆菌 CMCC (B) 44102 乙型副伤寒沙门
5、杆菌 CMCC (B) 50094 生孢梭菌 CMCC(B)64941 白色念珠菌 CMCC(F)98001,、菌种保藏的原则,菌种保藏的原理 微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。,、菌种的传代和使用,工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代防止过度的传代造成菌种变异,工作菌株不可代替标准菌株. 任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。,标准菌株,一般是从菌种保藏中心或专业实
6、验室购买得到的，用符号S表示。一般可保存5年。 按菌种保藏中心的要求进行恢复培养。中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)建议的方法如下： 安瓿管开封：用浸过70酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用火焰将安瓿管顶端加热，滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，用锉刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。 菌株恢复培养：用无菌吸管，吸取0.3-0.4ml适宜的液体培养基（如营养肉汤），滴入安瓿管内，轻轻振荡，使冻干菌体溶解呈悬浮状，取约0.2ml菌体悬浮液，移植于指定的琼脂斜面/平板培养基上，剩余的菌液，注入指定的液体培养基内（3-4ml），然后在建议的温度下（一般培养温度32.52.5，1824h）培养。,
7、标准储备菌株,标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株.冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得重新冷冻或再次使用。 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法，用于菌种的传代，。甘油冷冻管保藏法一般可保存2年；,甘油冷冻管保存法,甘油冷冻管保存法适用于保存传代用菌种，一般可保存2年。 将待保存用菌种接种至平板或琼脂斜面，经372448h培养后，用无菌接种环轻轻刮 取菌苔，移至预先装有无菌蒸馏水的试管中，调整菌液浓度，使其等同于1单位麦氏比浊管。 向已制备好的菌悬液中加入等体积，浓度为20%的无菌甘油，得到10%甘油菌悬液。 轻轻振摇，使10%甘油菌悬液充分混合，分装于无菌小试管中，在
8、-30条件下贮存。,工作菌种,： 工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株 保存于半固体内或琼脂斜面培养基中，作为工作用菌种，用符号W表示。一般可保存12个月。严格控制传代次数，工作菌种不超过五代， 冻干菌种营养肉汤半固体琼脂或甘油水100支冰箱保存 （原代）（一代）（二代）,菌种的管理,严格的程序化管理 实验室必须建立菌种保存和使用文件的程序管理制度,菌种的销毁,1方法：菌种销毁采用高压蒸汽灭菌：121，20分钟。 2需及时销毁处理菌种：发生污染或变异的菌种；超过保存期限的菌种；使用后的菌种。,实验室的布局和运行,实验室布局设计的基本原则 具有检测所需的适宜、充分的设施
9、条件。 合理的布局与设计，具有独立的实验室、 辅助区域各区域应有明确标识。 建立控制程序和标准操作规程。,建立合理的控制程序和标准操作规范,对进出洁净区域的人和物建立控制程序和标准操作规程。 消毒剂的配制应按标准操作规程配制，对所用的消毒剂种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。,建立检样品传递、储存、处置和识别管理程序。 建立带菌培养物溢出的意外事件制定处理规程。 建立合理的取样控制程序和标准操作规范。,设 备 实验室应配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备，其类型、测量范围和准确度等级应满足检验所采用标准的要求，设备的安装和布局应便于操作，易于维护、清洁和校准。使用的消毒剂应无菌。 建立相应的
10、操作和维护和保养的标准操作规程。,文件,文件应当充分表明试验是在实验室里按可控的检查法进行的，一般包括以下方面：质量管理文件、程序文件、技术操作文件。,实验记录的保存,实验结果可靠性的依赖于试验严格按照标准操作规程进行，包括正确的试验操作、实验记录、(所有关键的实验细节)，以便确认数据的完整性。,结果的判断,由于微生物试验的特殊性，在实验结果分析时，应从各个可能的方面去考虑，不但要假设被污染，而且要考虑微生物在原料、辅料或试验环境中存活的可能性。此外，还应考虑微生物生长特性。,如果依据分析调查结果发现试验有错误而判实验结果无效，那么这种情况必须记录。实验室也必须认可复试程序，如果需要，可按相关
11、规定重新抽样，但抽样方法不能影响不符合规定结果的分析调查。,二：2010年版无菌检查法增修订内容,一、进一步确定了无菌检查法的定义： 无菌检查法系用于检查要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。 二、进一步明确了无菌检查保障 1、检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染 ，但采用的措施不得影响微生物的生长。 2 、无菌检查要进行环境检测增加了日常检验还需进行环境检测。 2、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。,三、培养基增修订内容,删去硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的使用范围(用于培养好氧菌、厌氧菌及用于培养真菌) 删去选择性培养基使用
12、的表面活性剂种类对氨基苯甲酸、聚山梨酯-80等。 理由 经验证试验选择适宜的中和剂、灭活剂和表面活性剂,培养基适用性检查增修订内容 3、培养基灵敏度试验 删除 菌悬液制备中黑曲霉菌悬液的制备 “（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）” 修改为“用适宜的方法吸出孢子悬液”。 增加在稀释液0.9%无菌氯化钠溶液中加入0.05v/v）聚山梨酯80。,四、试验稀释液、冲洗液增修订为 增加根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。 试验中使用的中和剂、灭活剂和表面活性剂除证明其有效性外还应证明对污染的微生物无影响修改为无毒性。,五、方法验证试验增修订内容,试验
13、菌株 删除铜绿假单胞菌增加大肠埃希菌及大肠埃希菌菌液的制备(同金黄色葡萄球菌)。 薄膜过滤法 供试品用量 将规定量供试品 按薄膜过滤法过滤 修改为取每种培养基规定接种的供试品总量。,六、供试品的无菌检查增修订内容,检验量 直接接种法除另有规定外，每份培养基接种的供试品量按表2、表3规定删除采用直接接种法时的规定。 阴性对照 无菌试验中若使用表面活性剂等应证明其有效性且对微生物生长无影响修改为无毒性。,薄膜过滤法 增加了抗生素供试品滤膜选择的指导 应选择低吸附的滤器及滤膜。 若需要冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，且冲洗量不宜过大修改为总冲洗量不得超过1000ml 。 水溶液供试品
14、含抑菌成分需用适量的冲洗液冲洗膜修改为所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验.,装有药物的注射器供试品 取规定量，删去装上无菌针头.修改为排出注射器中的内容物至无菌容器中，若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解，或非水溶性制剂供试品项下方法操作。 无菌气雾剂供试品 供试液的制备将供试品置冰室修改为置至少 -20的冷冻室约1小时。, 直接接种法删除内酰胺类或磺氨类供试品。,表1 、表2 、表3增修订,表1 （第3列）接种每种培养基改为所需的最少检验数量 表2 （表题）上市抽验样品（液体制剂）的最少检验数量修改为液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量 第二列每支样品接入每管培养基的最少样品量
15、修改为每支供试品接入每管培养基的最少样品量 第三列最少检验数量（瓶或支）1 全量 0 修改为供试品最少检验数量（瓶或支） 0 注 每种培养基各接种支供试品修改为若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。,表3 （表题）将上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量 修改为固体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量” 第三列最少检验数量、1 全量 0 修改为供试品最少检验数量（瓶或支） 0 注 每种培养基接种支培养基修改为若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。,三： 微生物限度检查增修定内容,修改内容,1、培养条件 控制菌培养温度353
16、7修改为3035(细菌、控制菌培养温度相同)。 修改理由 此温度适于所有中温菌生长，一些高温菌在该温度下也可以生长。,增修订内容,2、结果报告 特殊品种可以最小包装单位报告 特殊品种包括 药典规定微量包装药品的检验量可以酌减。 还有一些贵重药品也应考虑检验量。,3、检验量增修订内容,中药膜剂检验量50 cm2 修改为100cm2 。 沙门菌检验量修改为检验量为20 g或20ml并注明（其中10 g用于阳性对照）。,4、供试液的制备增修订内容,供试品检查时使用表面活性剂应证明其对 微生物生长和存活无影响修改为无毒性。 供试液的制备若需加温时，可采用其他经 验证的方法，但应均匀加热，且温度不应超 过45。,新增贴剂供试液制备,供试液的制备 经验证方法制备成供试液在无菌环境进
