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1、1无筛板型固相萃取柱的制备及其在食品中苯甲酸的测定研究作者：宋文青刘亚雄王琴包建民【摘要】 结合固相萃取(SPE)盘与含支撑物的 SPE 柱技术，制备了一种新型的无筛板型固相萃取柱。以 C18 填料为例，以话梅样品为介质对其中的苯甲酸进行分析，并用传统固相萃取小柱平行比较;将 SPE 与 HPLCUV 结合，考察了填料对简单介质中苯甲酸的最大吸附量及洗脱曲线，研究了新型 SPE 柱在实际应用中的分离纯化效果。结果表明，新型 SPE 柱对样品的吸附效果更好，规格为 200 mg/3 mL 的 SPE 柱对苯甲酸的吸附量达到 0.951 mg，超过了传统柱的吸附量0.908 mg;其洗脱曲线与传统
2、柱几乎重合;苯甲酸在 1100 mg/L 浓度范围内线性关系良好， r=0.9999，用此 SPE 柱纯化后的样品加标回收率和相对误差分别在88.4%102.3%和 1.4%2.9%之间。 【关键词】 固相萃取柱，筛板，填料，苯甲酸1 引 言固相萃取(SPE)是一种试样预处理技术，由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来1。作为液体试样制备方法，SPE 优于传统的液液萃取法(LLE)，如无乳化现象;不需要使用超纯溶剂，有机溶剂消耗低，对环境污染小;适用于小体积试样;处理样品速率快，尤其适于处理挥发性及对热不稳定药物2,3。SPE 柱是 SPE 最普通的使用形式，一般的 SPE 柱是在类似于注射筒
3、的塑料或玻璃柱管中填装适量的填料，上下各加一片聚乙烯筛板为支撑体4。这种筛板在使用中会产生诸如非特异性吸附和通道效应等问题，影响了萃取效率。SPE 盘是 SPE 的另一种形式。它是通过选择性质稳定、粘合性好的特定的固化剂，将其与 SPE 吸附剂相互混合，用特殊的工艺压制成坚固的圆片。由于吸附剂被固化剂紧密地粘合在一起，减少了吸附剂之间的死体积，在萃取时无通道效应，因而萃取效率得到提高5,6。这种盘片一般适用于处理较大体积的液体，但是由于该膜片无支撑体，使用范围受到了限制。本研究在现有 SPE 盘技术的基础上，将另一种含支撑体系的 SPE 柱技术的思想与之结合，把填料和支撑物用粘合剂进行固化，制
4、得一种新型整体性填料。利用此填料开发了一种全新的无筛板 SPE 小柱并对其各项性能和指标进行了系统的评价。苯甲酸作为常用的防腐剂广泛存在于食品中，国家对其使用有严格的限量标准，过量使用会对人体产生危害，因而对存在于食品中的苯甲酸的检测是非常必要的7,8。本研究选取存在于不同介质中的苯甲酸作为样品，评价了此种新型 SPE 小柱的色谱能力。无筛板 SPE 的最大优势表现为：无需多孔筛板的支撑，避2免了筛板的非特异性吸附，提高了分离效率和回收率;所利用的惰性材料减少了SPE 上样过程中的多通道沟流效应，提高了分离效率和载样量; 适用于比常规SPE 填料小得多的超细填料。2 实验部分2.1 仪器与试剂
5、XL30 环境扫描电镜(Philips 公司); 1100 高效液相色谱仪(安捷伦公司);QT6150 超声机(天津市瑞普电子仪器公司);5415c 离心机(Eppendorf Centrifuge);传统和新型的 SPE 小柱均由天津奥秘科技有限公司提供。苯甲酸(99%，天津一方科技有限公司);乙酸铵、甲苯、丙酮、二氯甲烷均为分析纯，甲醇为色谱纯(天津大学科威公司);水为去离子水;九制话梅由商店购得。2.2 色谱条件FujiC18 色谱柱(150 mm4.6 mm， 5 m，天津市三维色谱仪器配件厂);流动相：V(甲醇)V(0.02 mol/L 乙酸铵)=1090;流速：0.8 mL/min
6、;检测波长：230 nm;进样量：20 L。2.3 实验方法2.3.1 碳十八烷基填料的键合9 取硅胶 10.0 g，用 6 mol/L HCl 进行酸洗后，抽吸过滤，蒸馏水洗至洗出液呈中性，烘干。将处理好的硅胶放入三口烧瓶中，固定在油浴上，右侧接滴液漏斗，内装十八烷基三氯硅烷 13.6 mL 和甲苯20.0 mL，漏斗上端封闭，左侧接真空泵。开启真空泵抽真空 2 h，使油浴温度控制在 150 。加热完毕后，待油浴温度降至 50 左右，关闭真空泵，边搅拌边缓慢加入硅烷化试剂和甲苯混合液，右侧加入 0.5 mL 三乙胺后，左侧立刻通入 N2，右侧连接冷凝装置，启动加热开关，控制反应液温度 130
7、 ，连续回流反应 3 h。冷却至室温。抽滤，依次以甲苯、甲醇、二氯甲烷洗涤硅胶 2 次，最后用丙酮洗涤抽滤，将硅胶放入电热真空干燥箱(80 ，0.04 MPa，3 h)，冷却至室温即得产品。2.3.2 新型填料的制备及表征 取适量 C18 填料，依照不同产品性能的要求调整不同比例(如 20%30%)结构性添加物的复合粘合剂，在充分混匀后，加压成型，即可得此具有整体性的填料。将两种填料彻底干燥后进行电镜扫描，可看出表面结构的差异，放大倍数为 100 倍。2.3.3 填装 传统固相萃取是时将填料装填在两个挡板之间，而新型固化填料无需挡板，直接装填压匀即可使用。每种小柱都分别装有 200 mg/3
8、mL，500 mg/6 mL 两种规格。2.3.4 苯甲酸的吸附测定 以 0.02 mol/L 乙酸铵水溶液为溶剂，分别配制 1.0和 2.0 g/L 的苯甲酸溶液。取 1.0 g/L 样品溶液 1 mL 通过已用 3 mL 甲醇和 3 3mL 水清洗活化了的规格为 200 mg/3 mL 的 SPE 柱，3 mL 甲醇洗脱，流速 1 mL/min，结合 HPLC 按外标法测定洗脱液中苯甲酸的含量;再分别取 2.0 g/L 样品溶液 1 mL 通过已活化的规格为 500 mg/6 mL 的 SPE 柱，5 mL 甲醇洗脱 1.0 g/L 苯甲酸溶液，同法进行定量测定。比较两种 SPE 柱对苯甲
9、酸的吸附值。取 1.0 g/L 苯甲酸溶液 1.0，1.2，1.4，1.6，1.7 及 1.8 mL，分别通过已活化的规格为 200 mg/3 mL 的 SPE 柱，3 mL 甲醇洗脱，流速为 1 mL/min;另取2.0，3.0，4.0，4.5，4.8 和 5.0 mL 的 1.0 g/L 苯甲酸溶液，分别通过已活化的规格为 500 mg/6 mL 的 SPE 柱，5 mL 甲醇洗脱，流速为 1 mL/min，同法进行定量测定，计算出两种 SPE 小柱对苯甲酸的最大吸附值。以 0.02 mol/L 乙酸铵水溶液为溶剂，配制 200 mg/L 苯甲酸样品溶液。取1 mL 分别通过两种已活化的
10、SPE 柱(200 mg/3 mL)，再依次用水、10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%及 100%甲醇水溶液洗脱，洗脱液体积为 3 mL，流速为 1 mL/min，HPLC 定量测定，计算出两种 SPE 小柱的累积洗脱量。2.3.5 复杂介质中苯甲酸含量的测定 配制浓度为 1.0，5.0，25.0，50.0和 100.0 mg/L 苯甲酸标准溶液。经 0.45 m 滤膜过滤后分别取 20 L 注入色谱仪，测定峰面积，以峰面积对浓度作曲线。取 10.0 g 话梅肉于 50 mL 小烧杯中，加去离子水 25 mL，超声提取 10 min，4000 r/min 离心
11、 10 min，取上清液，去离子水定容至 30 mL 10。分别取上述溶液 2 mL 通过已活化的规格为500 mg/6 mL 的两种 SPE 柱，用 5 mL 70%甲醇水溶液以 1 mL/min 流速分析洗脱，收集洗脱液，经 0.45 m 滤膜过滤后，待测。3 结果与讨论3.1 填料的表征由图 1 可见,传统 C18 填料颗粒之间具有一定的空隙(图 1a);而添加了粘合剂的 C18 填料(固化后)颗粒紧密地聚集在一起(图 1b)，上样以后避免了多通道沟流的形成。3.2 简单介质中苯甲酸的测定3.2.1 填料对苯甲酸吸附能力的测定 以苯甲酸为分析物，乙酸铵水溶液为溶剂，考察了不同规格 SPE
12、 小柱对不同浓度样品的吸附，每个规格 4 个柱子平行测试(柱规格为 200 mg/3 mL)。结果显示，添加了粘合剂的新型 SPE 小柱对苯甲酸的平均吸附量为 0.951 mg, 优于传统的 SPE 小柱平均吸附量 0.908 mg。当流出液中样品含量超过加入量的 10%时，通常视为小柱达到最大吸附量。考察了新型 SPE 小柱与传统 SPE 小柱对苯甲酸的最大吸附量，结果见图 2。两种规格的新型 SPE 柱的吸附量均较传统柱略高。43.2.2 洗脱曲线的测定 如图 3 所示，随着甲醇比例的增加，洗脱率逐渐提高，以 3 mL 40%甲醇水溶液基本可以将苯甲酸完全洗脱。两种类型的 SPE 小柱在同
13、时经历不同洗脱液条件直接对比下，对于苯甲酸的吸附几乎是相同的，表明新型 SPE 小柱的色谱性能未受影响。3.3 复杂介质中苯甲酸的测定苯甲酸在 1100 mg/L 范围内线性关系良好，其回归方程为Y=87.229X(mg/L)-7.503，相关系数 r=0.9999。1. 新型 SPE (Novel SPE); 2. 传统 SPE (Traditional SPE)。通过比较未经 SPE 小柱预处理话梅样品的 HPLC 谱图以及分别用两种 SPE 小柱纯化了的样品HPLC 谱图来评价新型 SPE 小柱对于预处理复杂样品的能力(见图 4)。新型 SPE小柱的分离纯化效果更好，测得话梅中苯甲酸含量
14、 3.05 mg/L(见表 1)。图 4 未经 SPE 柱纯化的样品溶液(a)，经新型 SPE 柱纯化的样品溶液(b)和经传统 SPE 柱纯化的样品溶液(c)的 HPLC 谱图Fig.4 Chromatogram of sample without purification(a), sample purificated with novel SPE(b) and sample purificated with traditional SPE(c)表 1 经不同种 SPE 纯化后所得色谱图峰面积3.4 方法精密度与加标回收率选用待测话梅样品，分别加入 0.1，0.5 和 1.0 g/kg 的苯甲
15、酸标准溶液，按照 2.3.5 节的方法处理样品。每个浓度水平测定 5 次，分别计算其方法的精密度及加标样品的平均回收率(n=5)，将新型 SPE 柱与传统 SPE 柱比较(SPE 柱规格为500 mg/6 mL)，结果见表 2。经新型 SPE 柱纯化的样品的添加回收率在88.4%102.3%之间，RSD 值小于 2.9%。结果表明，所制备新型 SPE 柱具有较好的分离纯化能力。表 2 方法精密度与回收率【参考文献】1 Johanna Tollback, Maria, Blasco Bigata, Carlo Crescenzi, Johan Strom. Anal. Chem., 2008,
16、80: 315931672 Zhang HaiXia(张海霞), Zhu PengLing(朱彭龄). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2000, 28(9): 117211803 Gaurav Saini, Li Y, Milton L Lee, Andrew Dadson, Michael A. Vail, Matthew R. Linford, Anal. Chem., 2008, 80: 625362594 Thurman E M, Kirk Snavely. Trends in Analytical Chemistry, 2000, 19(1): 182755 Scott Senseman, Thomas Mueller, Melissa Riley. J. Agric. Food Chem., 2003, 51: 374837526 Lai YuHong(赖宇红), Chen HaoAn(陈浩桉). Guangdong
