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1、1改构型酸性成纤维细胞生长因子对紫杉醇诱导的人胚肝细胞 L-O2 及人胚肾细胞 293 损伤的保护作用作者:韦敏,李丹妮,刘华钢,刘丽敏【摘要】 目的观察紫杉醇对人胚肝细胞 L-O2 及人胚肾细胞 293 的毒性作用,及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护,并探讨其可能机制。方法用紫杉醇诱导人胚肝细胞 L-O2 及人胚肾细胞293 损伤,同时加入 aFGF 对肝、肾细胞进行保护,并测定培养上清液中的SOD,MDA,LDH 值,MTT 法测定肝、肾细胞活性。结果紫杉醇在体外对人胚肝细胞 L-O2、人胚肾细胞 293 有一定的毒性作用,使用 aFGF 对肝
2、、肾细胞进行保护后,IC50 值有明显的提高,SOD 值与未加 aFGF 组相比明显升高,而 MDA,LDH 值明显降低(P0.05)。结论 aFGF 可有效对抗紫杉醇引起的肝、肾细胞损伤。 【关键词】 改构型酸性成纤维细胞生长因子;紫杉醇;人胚肝细胞 L-O2;人胚肾细胞 293;保护作用Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effects of aFGF on paclitaxel-induced nephrotoxicity in human liver cell L-O2 and human kidney cell 293 an
3、d its possible mechanism.MethodsThe effect of aFGF on paclitaxel-induced nephrotoxicity was evaluated by MTT assay. The contents of SOD,MDA and LDH in cultural supernatant were determined by general methods.Results Paclitaxel could inhibit the proliferation of human liver cell L-O2 and human kidney
4、cell 293 in a dose-dependent manner. aFGF could protect human liver cell L-O2 and human kidney cell 293 injury induced by paclitaxel(P0.05).ConclusionPaclitaxel has the function of inhibiting proliferation on human liver cell L-02 and aFGF can exert obvious protective effects on the cells.Key words:
5、 AFGF ;Paclitaxel;Human liver cell L-O2;Human kidney cell 293;Protective effect紫杉醇是由红豆杉树皮中提取具紫杉烷骨架的二萜类化合物,主要来源于植物,其脂溶性高,水溶性差,制成油剂抗癌活性高,对乳腺癌、卵巢癌有突出疗效1,2。紫杉醇注射液在抗癌药物中是一个作用机制非常独特的药物,通过诱导和促使微管蛋白聚合成微管的解聚,从而导致微管束的排列异常,形成星状体,使细胞在有丝分裂时不能形成正常的有丝分裂纺锤体,抑制了细胞的分裂和繁殖,导致癌细胞死亡。据报道在治疗量时,紫杉醇的不良反应主要报道为胃肠道反应,白细胞下降等,一般来
6、说,抗肿瘤作用强的药物毒性也大,但对于紫杉醇在体外的肝、肾毒性如何,未见有文献报道。本实验考察了紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2 及人胚肾细胞 293 的毒性作用,及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子2(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护,并探讨其可能机制。1 材料与仪器1.1 试剂人胚肝细胞 L-O2、人胚肾细胞 293(南京凯基生物科技发展有限公司);aFGF(广西医科大学基础实验室提供,含量为 0.52 g/ml);紫杉醇(哈尔滨三联药业有限公司,批号 200806033); MTT(Sigma 公司);DMSO(Sigma 公司);RPMI-1640 培养基(美国 GIBCOB
7、RL 公司);DMEM(美国 GIBCOBRL 公司);胎生牛血清(杭州四季青生物材料研究所);胰蛋白酶(美国 Amresco 公司);谷氨酰胺(美国Amresco 公司);PBS(美国 Amresco 公司);HEPES(Sigma 公司);LDH、MDA、 SOD 试剂盒(南京建成生物工程研究所)。1.2 仪器二氧化碳培养箱(美国 Forma Scientific 公司);倒置显微镜(日本Olympus 公司);酶标仪(芬兰 thermo 公司);超低温冰箱(日本三洋公司);96 孔培养板(美国 BIO-RAD 公司);6 孔培养板(美国 BIO-RAD 公司);超净工作台(苏州净化设备厂
8、);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);电子天平(上海天平仪器厂);电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂);722S 紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。2 方法2.1 细胞培养人胚肝 L-O2 细胞和人胚肾细胞 293 的培养分别采用 RPMI-1640和 DMEM 培养基加 10%灭活 FBS 于 5% CO2,37培养箱饱和湿度培养,2 d 换液1 次。实验中所用细胞均处于对数生长期,活细胞数大于 95%。2.2 紫杉醇的配置精密称定紫杉醇标准品适量用 DMSO 溶解后,用无血清培养液依次稀释,配置成 30,15,7.5,3.25,1.625 g/ml 浓度梯度的紫杉醇系列浓度样品,置
9、于 4冰箱中保存备用。2.3MTT 法测定紫杉醇的肝肾毒性及 aFGF 对肝肾的保护作用取对数生长期的人胚肝细胞 L-O2 和人胚肾细胞 293 用胰酶消化后,分别用 RPMI-1640 和 DMEM 培养液吹打制成细胞悬液分别加入 96 孔培养板,每孔 190 l,在 5%CO2,37培养箱培养 24 h 待细胞完全贴壁后,实验孔加入不同浓度紫杉醇标准液 10 l 每个浓度设 12 个复孔,其中 6 孔每孔同时加入 0.52 g/ml 的 aFGF 10 l,阴性对照孔 3 孔,加入含 0.5%DMSO 的无血清培养基 10 l,空白对照孔 3 孔加入200 l 的含药无血清培养基,培养箱孵
10、育 20,44 h,加入 5 mg/ml 的 MTT 10 l,继续在培养箱培养 4 h,取出 96 孔板顷去上清液,加入 DMSO 每孔 150 l,在摇床上振动摇匀 10 min,在酶标仪 570 nm 和 630 nm 的波长下测得各孔OD 值。按下式计算紫杉醇对人胚肝细胞 L-O2 和人胚肾细胞 293 的抑制率。抑制率(%)=对照组 OD 值-实验组 OD 值对照组 OD 组100%实验重复 3 次,计算平均抑制率及 IC50 值。2.4 紫外分光光度法测定紫杉醇的肝肾毒性及 aFGF 对肝肾的保护作用取对数生长期的人胚肝细胞 L-O2 和人正常胚肾细胞 293 用胰酶消化后,分别用
11、3RPMI-1640 或 DMEM 培养液吹打制成细胞悬液加入 6 孔培养板,每孔 1.9 ml,在5%CO2,37培养箱培养 24 h 待细胞完全贴壁后,实验孔加入 7.5 g/ml 紫杉醇 0.1 ml,对照孔除加入紫杉醇外另外加入 0.52 g/ml aFGF 0.1 ml,另设空白对照组。在药物作用的 12,24,48 h 后,取培养液的上清液按SOD,MDA,LDH 试剂盒中方法进行 SOD,MDA,LDH 的测定。2.5 统计学软件处理数据数据以 s 表示,采用 SPSS13.0 软件进行处理。采用 Bliss 法求算 IC50 值。3 结果3.1MTT 测定结果在 1.62530
12、 g/ml 浓度范围内,紫杉醇作用后的人胚肝细胞 L-O2 和人胚肾细胞 293 的百分抑制率值随紫杉醇浓度的增加而增加,呈现线性关系。说明紫杉醇具有一定的肝肾毒性。加入 aFGF 进行细胞保护后紫杉醇的 IC50 值显著提高。结果见表 12。表 1 紫杉醇的肝毒性测定及 aFGF 的保护作用表 2 紫杉醇的肾毒性测定及 aFGF 的保护作用3.2 紫外分光光度法测定 aFGF 对肝肾的保护作用结果 aFGF 可以有效抑制紫杉醇引起的肝肾细胞损伤,实验组与对照组的 SOD,MDA,LDH 结果有显著性差异(P0.05)。结果见表 3。表 3aFGF 对抗肿瘤药物引起人肝 L-02 损伤的保护作
13、用4 讨论aFGF 是纤维原细胞生长因子家族中的一员,有许多功能。如调节细胞增殖、移行、分化和生存等3,4。aFGF 主要作用于中胚层和神经外胚层来源的组织细胞表面,其生理功能与机体的器官和组织的形态发生、血管新生、创伤修复等有关5,6。它能促进有丝分裂,等电点为 57,相对分子量为 16.5103,大约由 154 个氨基酸组成7。由于野生型 aFGF 的促分裂活性与细胞增殖、分化以及肿瘤发生可能存在一定的联系,因而在大规模应用时受到一定限制。通过基因工程技术,将野生型 aFGF 进行改构,能产生一种突变体 aFGF,该突变体 aFGF失去了促分裂效应,但仍保留非促分裂因子样活性。改构型 aF
14、GF 去掉了促分裂活性,减少了人们对临床应用 aFGF 诱发肿瘤形成的担心。据报道 aFGF 对顺铂诱导的肾损害有一定的保护作用8,但其对紫杉醇诱导的肝肾细胞损伤的保护作用如何,未见有文献报道。本文采用人胚肝细胞 L-O2 和人正常胚肾细胞 293 体外培养,在细胞水平研究 aFGF 对肝肾细胞损伤的保护作用。SOD 值降低表示细胞被损伤越严重。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基,后者能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸,引发脂质过氧化作用,并因此形成过氧化物。测试 MDA 的量可反映机体内脂质过氧化的程度,间接反映出细胞损伤的程度。MDA 越大表示细胞受损越严重,实验结果证实随药物作用时间的延长,
15、MDA 增大,即肝、肾细胞受损越严重,亦说明紫杉醇的肝、肾毒性随时间的延长而增加。通过直接比较每组培养孔 LDH 的活性来判断药物的细胞毒性,细胞培养液中 LDH 活性越高,表示药物细胞毒性越大,细胞膜通透性越高,细胞受损伤越严重。实验结果证实随药物作用时间的延长,药物对肝肾的毒性越大。加入aFGF 对肝、肾细胞进行保护后 SOD 值与未加组相比有明显升高,MDA,LDH 的值4与未加组相比有明显下降。本实验研究结果表明,aFGF 对抗肿瘤药物引起的肝肾细胞损伤具有一定的保护作用。【参考文献】1Rowinsky EK.The development and clinical utility o
16、f the taxane class of antimicrotubule chemotherapy agentsJ.Annu Rev Med,1997,48(3):353.2赵俊生. 紫杉醇注射液的不良反应分析及临床合理应用J.山西医药杂志,2008,37(6):558.3Laird JM,Mason GS,Thomas KA,et al.Acidic fibmblast growth factor stimulates motor and sensory axon regeneration after sciatic nerve crush in the ratJ.Neuroscience,1995,65(1):209.4Lee YS,Baratta J,Yu J,et al.AFGF promotes axonal growth in rat spinal cord organotypic slice co-culturesJ. J Neurotr