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1、1改构型酸性成纤维细胞生长因子对紫杉醇诱导的人胚肝细胞 L-O2 及人胚肾细胞 293 损伤的保护作用作者：韦敏，李丹妮，刘华钢，刘丽敏【摘要】 目的观察紫杉醇对人胚肝细胞 L-O2 及人胚肾细胞 293 的毒性作用，及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护，并探讨其可能机制。方法用紫杉醇诱导人胚肝细胞 L-O2 及人胚肾细胞293 损伤，同时加入 aFGF 对肝、肾细胞进行保护，并测定培养上清液中的SOD，MDA，LDH 值，MTT 法测定肝、肾细胞活性。结果紫杉醇在体外对人胚肝细胞 L-O2、人胚肾细胞 293 有一定的毒性作用，使用 aFGF 对肝
2、、肾细胞进行保护后，IC50 值有明显的提高，SOD 值与未加 aFGF 组相比明显升高，而 MDA，LDH 值明显降低(P0.05)。结论 aFGF 可有效对抗紫杉醇引起的肝、肾细胞损伤。 【关键词】 改构型酸性成纤维细胞生长因子;紫杉醇;人胚肝细胞 L-O2;人胚肾细胞 293;保护作用Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effects of aFGF on paclitaxel-induced nephrotoxicity in human liver cell L-O2 and human kidney cell 293 an
3、d its possible mechanism.MethodsThe effect of aFGF on paclitaxel-induced nephrotoxicity was evaluated by MTT assay. The contents of SOD,MDA and LDH in cultural supernatant were determined by general methods.Results Paclitaxel could inhibit the proliferation of human liver cell L-O2 and human kidney
4、cell 293 in a dose-dependent manner. aFGF could protect human liver cell L-O2 and human kidney cell 293 injury induced by paclitaxel(P0.05).ConclusionPaclitaxel has the function of inhibiting proliferation on human liver cell L-02 and aFGF can exert obvious protective effects on the cells.Key words：
5、 AFGF ;Paclitaxel;Human liver cell L-O2;Human kidney cell 293;Protective effect紫杉醇是由红豆杉树皮中提取具紫杉烷骨架的二萜类化合物，主要来源于植物，其脂溶性高，水溶性差，制成油剂抗癌活性高，对乳腺癌、卵巢癌有突出疗效1，2。紫杉醇注射液在抗癌药物中是一个作用机制非常独特的药物，通过诱导和促使微管蛋白聚合成微管的解聚，从而导致微管束的排列异常，形成星状体，使细胞在有丝分裂时不能形成正常的有丝分裂纺锤体，抑制了细胞的分裂和繁殖，导致癌细胞死亡。据报道在治疗量时，紫杉醇的不良反应主要报道为胃肠道反应，白细胞下降等，一般来
6、说，抗肿瘤作用强的药物毒性也大，但对于紫杉醇在体外的肝、肾毒性如何，未见有文献报道。本实验考察了紫杉醇在体外对人胚肝细胞L-O2 及人胚肾细胞 293 的毒性作用，及加入改构型酸性成纤维细胞生长因子2(aFGF)后对紫杉醇引起的肝肾细胞损害的保护，并探讨其可能机制。1 材料与仪器1.1 试剂人胚肝细胞 L-O2、人胚肾细胞 293(南京凯基生物科技发展有限公司);aFGF(广西医科大学基础实验室提供，含量为 0.52 g/ml);紫杉醇(哈尔滨三联药业有限公司，批号 200806033); MTT(Sigma 公司);DMSO(Sigma 公司);RPMI-1640 培养基(美国 GIBCOB
7、RL 公司);DMEM(美国 GIBCOBRL 公司);胎生牛血清(杭州四季青生物材料研究所);胰蛋白酶(美国 Amresco 公司);谷氨酰胺(美国Amresco 公司);PBS(美国 Amresco 公司);HEPES(Sigma 公司);LDH、MDA、 SOD 试剂盒(南京建成生物工程研究所)。1.2 仪器二氧化碳培养箱(美国 Forma Scientific 公司);倒置显微镜(日本Olympus 公司);酶标仪(芬兰 thermo 公司);超低温冰箱(日本三洋公司);96 孔培养板(美国 BIO-RAD 公司);6 孔培养板(美国 BIO-RAD 公司);超净工作台(苏州净化设备厂
8、);台式离心机(上海安亭科学仪器厂);电子天平(上海天平仪器厂);电热恒温水浴锅(北京市医疗设备厂);722S 紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。2 方法2.1 细胞培养人胚肝 L-O2 细胞和人胚肾细胞 293 的培养分别采用 RPMI-1640和 DMEM 培养基加 10%灭活 FBS 于 5% CO2，37培养箱饱和湿度培养，2 d 换液1 次。实验中所用细胞均处于对数生长期，活细胞数大于 95%。2.2 紫杉醇的配置精密称定紫杉醇标准品适量用 DMSO 溶解后，用无血清培养液依次稀释，配置成 30，15，7.5，3.25，1.625 g/ml 浓度梯度的紫杉醇系列浓度样品，置
9、于 4冰箱中保存备用。2.3MTT 法测定紫杉醇的肝肾毒性及 aFGF 对肝肾的保护作用取对数生长期的人胚肝细胞 L-O2 和人胚肾细胞 293 用胰酶消化后，分别用 RPMI-1640 和 DMEM 培养液吹打制成细胞悬液分别加入 96 孔培养板，每孔 190 l，在 5%CO2，37培养箱培养 24 h 待细胞完全贴壁后，实验孔加入不同浓度紫杉醇标准液 10 l 每个浓度设 12 个复孔，其中 6 孔每孔同时加入 0.52 g/ml 的 aFGF 10 l，阴性对照孔 3 孔，加入含 0.5%DMSO 的无血清培养基 10 l，空白对照孔 3 孔加入200 l 的含药无血清培养基，培养箱孵
10、育 20，44 h，加入 5 mg/ml 的 MTT 10 l，继续在培养箱培养 4 h，取出 96 孔板顷去上清液，加入 DMSO 每孔 150 l，在摇床上振动摇匀 10 min，在酶标仪 570 nm 和 630 nm 的波长下测得各孔OD 值。按下式计算紫杉醇对人胚肝细胞 L-O2 和人胚肾细胞 293 的抑制率。抑制率(%)=对照组 OD 值-实验组 OD 值对照组 OD 组100%实验重复 3 次，计算平均抑制率及 IC50 值。2.4 紫外分光光度法测定紫杉醇的肝肾毒性及 aFGF 对肝肾的保护作用取对数生长期的人胚肝细胞 L-O2 和人正常胚肾细胞 293 用胰酶消化后，分别用
11、3RPMI-1640 或 DMEM 培养液吹打制成细胞悬液加入 6 孔培养板，每孔 1.9 ml，在5%CO2，37培养箱培养 24 h 待细胞完全贴壁后，实验孔加入 7.5 g/ml 紫杉醇 0.1 ml，对照孔除加入紫杉醇外另外加入 0.52 g/ml aFGF 0.1 ml，另设空白对照组。在药物作用的 12，24，48 h 后，取培养液的上清液按SOD，MDA，LDH 试剂盒中方法进行 SOD，MDA，LDH 的测定。2.5 统计学软件处理数据数据以 s 表示，采用 SPSS13.0 软件进行处理。采用 Bliss 法求算 IC50 值。3 结果3.1MTT 测定结果在 1.62530
12、 g/ml 浓度范围内，紫杉醇作用后的人胚肝细胞 L-O2 和人胚肾细胞 293 的百分抑制率值随紫杉醇浓度的增加而增加，呈现线性关系。说明紫杉醇具有一定的肝肾毒性。加入 aFGF 进行细胞保护后紫杉醇的 IC50 值显著提高。结果见表 12。表 1 紫杉醇的肝毒性测定及 aFGF 的保护作用表 2 紫杉醇的肾毒性测定及 aFGF 的保护作用3.2 紫外分光光度法测定 aFGF 对肝肾的保护作用结果 aFGF 可以有效抑制紫杉醇引起的肝肾细胞损伤，实验组与对照组的 SOD，MDA，LDH 结果有显著性差异(P0.05)。结果见表 3。表 3aFGF 对抗肿瘤药物引起人肝 L-02 损伤的保护作
13、用4 讨论aFGF 是纤维原细胞生长因子家族中的一员，有许多功能。如调节细胞增殖、移行、分化和生存等3，4。aFGF 主要作用于中胚层和神经外胚层来源的组织细胞表面，其生理功能与机体的器官和组织的形态发生、血管新生、创伤修复等有关5，6。它能促进有丝分裂，等电点为 57，相对分子量为 16.5103，大约由 154 个氨基酸组成7。由于野生型 aFGF 的促分裂活性与细胞增殖、分化以及肿瘤发生可能存在一定的联系，因而在大规模应用时受到一定限制。通过基因工程技术，将野生型 aFGF 进行改构，能产生一种突变体 aFGF，该突变体 aFGF失去了促分裂效应，但仍保留非促分裂因子样活性。改构型 aF
14、GF 去掉了促分裂活性，减少了人们对临床应用 aFGF 诱发肿瘤形成的担心。据报道 aFGF 对顺铂诱导的肾损害有一定的保护作用8，但其对紫杉醇诱导的肝肾细胞损伤的保护作用如何，未见有文献报道。本文采用人胚肝细胞 L-O2 和人正常胚肾细胞 293 体外培养，在细胞水平研究 aFGF 对肝肾细胞损伤的保护作用。SOD 值降低表示细胞被损伤越严重。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成过氧化物。测试 MDA 的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。MDA 越大表示细胞受损越严重，实验结果证实随药物作用时间的延长，
15、MDA 增大，即肝、肾细胞受损越严重，亦说明紫杉醇的肝、肾毒性随时间的延长而增加。通过直接比较每组培养孔 LDH 的活性来判断药物的细胞毒性，细胞培养液中 LDH 活性越高，表示药物细胞毒性越大，细胞膜通透性越高，细胞受损伤越严重。实验结果证实随药物作用时间的延长，药物对肝肾的毒性越大。加入aFGF 对肝、肾细胞进行保护后 SOD 值与未加组相比有明显升高，MDA，LDH 的值4与未加组相比有明显下降。本实验研究结果表明，aFGF 对抗肿瘤药物引起的肝肾细胞损伤具有一定的保护作用。【参考文献】1Rowinsky EK.The development and clinical utility o
16、f the taxane class of antimicrotubule chemotherapy agentsJ.Annu Rev Med，1997，48(3):353.2赵俊生. 紫杉醇注射液的不良反应分析及临床合理应用J.山西医药杂志，2008，37(6)：558.3Laird JM，Mason GS，Thomas KA，et al.Acidic fibmblast growth factor stimulates motor and sensory axon regeneration after sciatic nerve crush in the ratJ.Neuroscience，1995，65(1)：209.4Lee YS，Baratta J，Yu J，et al.AFGF promotes axonal growth in rat spinal cord organotypic slice co-culturesJ. J Neurotr
