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1、改善微循环保健类（功能试验）（动物试验）微循环是血液与组织细胞物质交换、保障新陈代谢的场所。在微循环障碍中血瘀证最常见，以疼痛、肿块、瘀斑为主要特征，其与血液循环、高黏滞状态、血小板功能、血栓形成等多种改变有关。因此改善微循环的保健用品应以活血化瘀、疏通血脉、祛除血瘀为主要功能。一、功效学研究思路：主以活血化瘀、疏通血脉、祛除血瘀；兼以镇痛、消肿、抗炎、止痒和恢复功能。二、试验模型和方法主要表现为血液流变学异常、微循环障碍、血流动力学异常等方面。 活血化瘀的主要药理作用有以下几个方面： 1扩张血管、增加器官血流量 研究对靶器官血管和血流量的作用。 2改善血液流变学 血瘀证一般有血液“浓、黏、凝
2、、聚”等血液流变学异常的倾向或表现。应研究改善血瘀状态下血液的“浓、黏、凝、聚”状态。 3抗血栓形成 研究受试物的改善血液流变学特性，减少血小板的黏着和聚集；降低血小板的表面活性，抑制血小板黏附、聚集和释放反应等；抗凝，改善血瘀证高凝状态；升高血管壁内前列腺环素，阻止血小板在血管壁聚集和血栓形成；增加纤溶酶活性，促进已形成的纤维蛋白溶解。 4改善微循环 研究受试品的作用机制：改善微血流，使流动缓慢的血流加速。改善微血管形态，解除微血管痉挛，减轻红细胞的瘀滞和汇集、减少微循环瘀血。降低毛细血管通透性，减少微血管周围渗血。5其他作用 如：降血压，改善机体状态，调节组织修复再生，抗炎，镇痛等。毛细血
3、管通透性试验：染料的浓度。三、注意事项：本类保健用品至少选用2个以上试验项目，证明受试物对微循环的改善作用。改善微循环保健类（人体试验）缓解腰痛人体试验（肩、膝、踝、肘关节痛可根据保健用品的作用部位参照此标准）一、功效指标（观察项目）1腰骶痛或不适（VAS评分）。2腰骶部晨僵。3臀部、腹股沟部酸痛。4症状有无向下肢放射。5疼痛和静止、休息时以及活动的关系。6疼痛影响睡眠的程度。7对腰部活动功能的改善程度。8缓解疼痛的起效时间和相应的人数比例。9疼痛消失的时间及相应的人数比例。10随访二、结果判定1试验组使用前后自身比较，原有部位疼痛明显减轻，VAS评分平均下降2.5分及其以上且有统计学差异；2
4、试验组与对照组组间比较，试验组原有部位疼痛明显减轻，VAS评分比对照组平均低2.5分及其以上且有统计学差异；3其他症状及体征有一定程度的改善；4总有效率65%以上，愈显率大于35% 。满足上述1、2、4项的标准，可判定该受试物对缓解腰痛及相应部位的关节痛及活动不利有保健作用。保健用品安全性试验方法一、皮肤急性毒性试验1.试验材料1.1动物：白色兔、白色豚鼠、大鼠。兔体重1.8Kg以上；豚鼠250-350g；大鼠180-210g。受试动物应皮肤光滑，无损伤，无皮肤病。1.2受试物：如为膏剂或者液体剂型。可直接涂抹于去毛皮肤上。若受试物是固体粉末或散剂，则需加适量水或者适当的赋形剂（如羊毛脂、凡士
5、林、橄榄油等）混匀，以保证受试动物与皮肤良好接触。2试验方法2.1 皮肤准备：在实验前24h，将动物背部脊柱两侧去毛（采用剪、剃或适宜的脱毛剂）。兔约150CM2。豚鼠和大鼠约40CM2。2.2 给受试物方法：受试物涂抹后以适当的方法固定，如无刺激性纱布、胶布或有孔尼龙绷带固定。大鼠或豚鼠也可用适当大小的橡皮套（剪去手指的橡皮手套）把整个背部和腹部包住。如受试物是液体，则应在其上敷以聚乙烯薄膜，然后再包扎固定，以防止液体挥发，实验过程中，要注意防止动物舔食受试物。2.3 剂量和分组：一般分3个剂量组，其中一个为赋形剂对照组，两个给受试物组，高剂量组剂量为低剂量的510倍。为了提高给受试物剂量可
6、提高浓度或增加24h内给受试物次数。如果受试物毒性较小，提高剂量不能引起动物出现明显毒性症状，可只设一个剂量组。大鼠或豚鼠每组10只，兔每组4只，雄雌各半。2.4 观察：动物分笼饲养。给受试物后24h，如未中毒死亡，可用温水或其他的无刺激性溶剂除去残留于皮肤的受试物或赋形剂。继续观察，连续7d，注意动物的全身中毒表现和死亡情况。毒性症状的观察项目：外观行为、异常运动、精神状态、食欲、大便、肤色、呼吸、异常分泌物等，如有动物死亡，应立即进行尸检和肉眼观察，当有肉眼可见病变时，则应进行病理组织学检查。2.5 结果评价：见表1 表1 皮肤急性毒性试验结果评价标准组别兔涂皮LD50（mg/Kg）极毒剧
7、毒中等毒低毒实际无毒554444350350218021803实验报告3.1 实验设计：动物种属、品系、规格、试验方法和皮肤去毛面积、受试物剂量，固定方法等。3.2 试验结果：列表表示分组、剂量、动物数、死亡数及急性中毒症状.3.3 根据试验结果的综合评价。二、皮肤长期毒性试验1材料1.1 动物：选用兔、豚鼠或大鼠。兔体重1.8Kg以上；豚鼠250-350g；大鼠180-210g。受试动物应皮肤光滑，无损伤。1.2 受试物：同皮肤急性毒性试验1.22试验方法2.1 剂量和分组：一般设高、低两个剂量组，和一个对照组。皮肤给受试物的高剂量组应是使动物产生严重中毒性反应或者有少数动物死亡剂量，低剂量
8、组应当相当或略高于功效学的有效剂量。但如皮肤急性毒性试验剂量超过临床用量20倍而未出现毒性反应及死亡者，可设一个相当于临床20倍以上的高剂量组和一个对照组。每组兔不少于6只，大鼠或豚鼠每组不少于10只。2.2 动物皮肤给受试物方法：皮肤准备、涂抹受试物和固定方法按皮肤急性毒性试验2.1，每周受试物7次，每日1次，每次至少接触6小时。2.3 试验周期，给受试物时间不少于使用周期的两倍。2.4 观察和结果：给受试物停止后，留下部分（约1/3）动物继续观察2周，观察毒性反应可逆程度，其他动物全部处死。并作血液学生化学和病理学检查，血液学指标：应检查红细胞、白细胞数，血红蛋白，白细胞分类。急性毒性试验
9、未发现明显毒性者，可简化为检查红、白细胞计数，白细胞分类和血红蛋白测定。血液生化学指标：应检查天门冬氨酸基转氨酶，丙氨酸氨基转氨酶，碱性磷酸酶，尿素氮，总蛋白，血糖，总胆红素，肌酐，总胆固醇。急性毒性试验未发现明显中毒者，至少应检查肝、肾功能各两项敏感指标。病理组织学检查：心、肝、肺、脾、肾、肾上腺、胰腺、胃、小肠、大肠、卵巢、子宫、睾丸、附睾、脑、眼结膜、角膜、皮肤、胸骨、受试部位的皮肤及皮下组织取材后立即放进10%福尔马林固定。可先作高剂量组和对照组的组织学检查，其他剂量组可取材10%福尔马林固定保存，在高剂量组有异常时再进行检查。但病理组织学检查中，受试物涂抹的局部皮肤应列为检查的一个重
10、要对象。3.试验报告3.1 试验设计：动物品种、规格、皮肤准备、剂量分组、给受试物周期，观察指标等。3.2 试验结果整理：包括检查观察的项目和结果，列表表示，并进行统计学处理，与对照比较的显著性差异情况。对病理学检查结果的客观描述。3.3 根据以上结果对受试物长期毒性进行评价。三、皮肤刺激性试验1 材料1.1 动物：选用兔或豚鼠、大鼠。兔体重1.8Kg以上；豚鼠250-350g。兔4只，豚鼠6只，雌雄各半。1.2 受试物：同皮肤急性毒性试验1.2。2试验方法2.1 皮肤急性刺激试验（一次皮肤涂抹试验）：a) 给受试物前24h，动物背部脊柱两侧毛剪掉，切勿引起皮肤损伤。采用左、右侧自身对照，分受
11、试物区和对照区，每区去毛范围左、右各约3cm6cm。各区之间应保留适当距离。涂抹受试物一定剂量，对照区涂等量赋形剂。用油纸和二层纱布覆盖，适当方法固定。24h后以温水或无刺激性溶剂去除残留受试物及赋形剂。再经1.24.48和72h观察涂抹部位的红斑和水肿等反应。b)结果判断与评价：每只动物试验结果按表2进行刺激反应评分，计算出平均分值并按表3进行刺激强度评价。刺激强度评价以其最高刺激强度为准。表2 皮肤急性刺激试验评价标准（1）刺激反应分值红斑：无红斑勉强可见中度红斑严重红斑紫红色红斑并有焦痂形成水肿：无水肿勉强可见轻度可见（边缘高出周围皮肤）皮肤隆起约1mm轮廓清楚水肿隆起1mm以上并范围扩
12、大0123401234最高总分值8 表3 皮肤急性刺激试验评价标准（2）刺激强度平均分值无刺激性轻度刺激性中度刺激性强度刺激性0.00.490.52.993.05.996.08.0c) 试验报告：1) 试验设计：包括动物种属、品系、去毛区面积、受试物和对照物。受试物涂抹部位和作用时间。2) 试验结果：每只动物的反应分值和平均分值，列表表示。3)判断：根据试验结果判定受试物对皮肤的刺激性强度，以及刺激反应的发展和恢复情况。2.2皮肤慢性刺激试验（多次皮肤涂抹试验）：a) 先将实验动物背部脊柱两侧皮肤的毛剪掉，去毛范围各为3cm6cm。取受试物一定剂量，涂抹在一侧，另一侧涂等量赋形剂作为对照，每天
13、涂抹12次，连续涂抹14天。每天涂前应剪毛，不得损伤皮肤，保证受试物与皮肤充分接触。每天观察皮肤反应，按表2评分。脱屑积分为1。最高刺激指数为14（观察次数）8（总积分数）=112。实验结束，用角膜环钻取涂抹部位皮肤进行病理组织学检查，按表4评分。b) 结果评价：按上述评定标准和指标的最高分值判断受试物的皮肤刺激作用的有无或刺激的强弱，多次皮肤刺激性试验刺激指数超过30、病理组织检查积分超过4，应判断受试物对皮肤有明显刺激性。c) 试验报告：内容同皮肤急性刺激试验。表4 皮肤慢性刺激试验（多次皮肤涂抹试验）评价标准皮肤改变积分最高1. 刺层肥厚（a） 棘层肥厚轻度（表皮为正常厚度1.53倍）中
14、度（表皮为正常厚度34倍）重度（表皮为正常厚度4倍）21332. 角化过度（b）颗粒层增厚（c）角化不全11113. 其他表皮改变（d）颗粒层缺乏(e) 角化不全 (f) 表皮细胞空泡化或细胞内水肿或基底细胞液化变性(g) 海绵形成棘细胞间水肿水泡形成1111211124. 表皮坏死（h）表皮坏死轻度（占表皮切面的1/3以下）中度（占表皮切面的1/32/3）重度（占表皮切面的2/3以上）81015155. 真皮变化（i）真皮结缔组织血管扩张充血或水肿 (j) 胶原纤维变性或解离(k) 真皮炎性细胞浸润 轻度 中度 重度11123113注：总分按（a+b+c+d+e+f+g）或（h）+(i+j+h)选择总分较大者。解离系指胶原纤维分离成细小碎片。四、 皮肤过敏性试验1试验材料1.1 动物：白色豚鼠30只，体重250350g，雌雄各半。在给受试物前24小时，将豚鼠背部两侧去毛，去毛范围每侧约33cm2。1.2 受试物：如为固体粉末，需用适量的赋形剂混匀，以保证受试物与皮肤的良好接触。如受试物是液体或半固体的膏剂，可直接用于试验。2试验方法2.1 实验分组：将豚鼠按体重、性别
