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1、1嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究作者：傅佳峰，叶盛，朱丹化，曾博，张宇，诸葛启钏【摘要】 目的: 嗅鞘细胞移植入大鼠脑出血模型后，观察偏瘫大鼠功能恢复以及移植细胞后 30 d 内的形态学变化。方法：差速贴壁法培养出高纯度的嗅鞘细胞，制作 38 只大鼠脑出血模型，分三组：第 1 组 10 只为空白组，第 2 组10 只为 HBSS 移植组，第 3 组 18 只为嗅鞘细胞移植组；三组大鼠分别在术后 3 d、7 d、14 d 和 30 d 用 forelimb placing 方法进行评分，判断嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血模型的作用。结果：hoechst 示踪及电镜观察结果，均证实嗅鞘细胞能在大
2、鼠体内存活；对三组大鼠进行评分，嗅鞘细胞移植组的功能恢复明显优于其他两组。结论：从成年大鼠嗅黏膜用差速贴壁法能成功培养出嗅鞘细胞，并用于细胞移植，移植细胞能存活；嗅鞘细胞移植能改善大鼠脑出血后偏瘫肢体的功能。 【关键词】 嗅鞘细胞；脑出血；模型，动物；细胞移植Abstract: Objective: To transplant the successfully cultured olfactory ensheathing cells to rat cerebral hemorrhage mode and to observe the neurological repair function o
3、f OECs and the shape of cells in hematoma and brain tissue of 30 days. Methods: High purification of olfactory ensheathing cells using the method of the differing rates in attachment of the various cells type was cultured. Thirty-eight rats of cerebral hemorrhage mode were established and divided in
4、to 3 groups ；the first group (10 rats) was the blank group ；the second group (10 rats) the HBSS transplanting group；the third group (18 rats) the OECs transplanting group. The three groups were all scored in 3 days， 7 days， 14 days and 30 days after operation by forelimb placing method. The contribu
5、tion of OECs transplanton for curing rat cerebral hemorrhage with statistics method was eraluated. Results: OECs were comfirmed alive by immunofluorescence frace method and electron microscope；after scoring the three groups by forelimb placing method and calculating them， Olfactory ensheathing cells
6、 injected significantly reduced motor deficits compared with the control groups after cerebral hemorrhage (P 0.05). Conclusion: OECs can be successfully cultrued using the method of the differing rates of attachment of the various cells type from adult mouse olfactory mucosa and can be used for cell
7、 transplanting ；OECs transplanting method is a method of curing rat cerebral hemorrhage.Key words: olfactory ensheathing cells；cerebral hemorrhage；modes；animal；cell transplantation2脑出血疾病在我国是一种危害人民健康的疾病，在脑血管疾病中当属最严重的一种，虽然其发病率只占其中的 20%左右，但其病残、死亡率都很高，是老年人死亡的首要原因1。神经干细胞方面研究取得的成功，使神经干细胞移植治疗脑出血成为了研究热点，但神经
8、干细胞也有其自身的缺点，比如，取材困难，存在伦理方面的问题，因此，有一种新的细胞引起了人们的注意，这就是嗅鞘细胞，嗅鞘细胞不仅有神经干细胞的特点，还有其自身的优点，如取材方便，从嗅黏膜即可获得嗅鞘细胞，能够避免伦理问题。笔者尝试用嗅鞘细胞移植来治疗大鼠脑出血，希望能为下一步的临床研究积累经验。1 材料和方法1.1 材料 雌性 SD 大鼠（250300 g，由温州医学院动物实验中心提供） ，DME/F12 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、VI 型胶原酶、HBSS 液、P75 NGFR、GFAP、FITC 标记的羊抗小鼠 IgG、hoechst 均由 GIBCO 公司提供，LEICA解剖显微镜，LEI
9、CA 倒置相差显微镜，水平离心机为 beckman 公司的 Avanti J-20 XP，荧光显微镜为 Olympus 公司产品，大鼠立体定向仪。1.2 方法1.2.1 嗅鞘细胞的原代培养及鉴定：参照改良的 Nash 差速贴壁法2进行培养：大鼠麻醉（水合氯醛，4 ml/100 g）后断首，在 75%酒精中浸泡 5 min 消毒，去除额骨和鼻骨，获得嗅黏膜后，放于盛有 HBSS 液的培养皿。培养皿均放置于冰块上降温，在 LEICA 解剖显微镜下严格无菌操作取嗅黏膜固有层，剪刀剪碎至大约 1 mm2 小块，用 0.25 胰蛋白酶在 37 孵箱中消化 15 min 左右，再用含 10%胎牛血清的培养
10、液终止消化，机械轻柔吹打 20 次，在水平离心机中以 200 r/min 离心 6 min，去除上清液，留沉淀物，加入含 10%胎牛血清的 DME/F12 培养液，37 ，5% CO2 孵箱中培养。细胞培养 72 h 后成纤维细胞及星形胶质细胞大部分贴壁生长，轻轻晃动培养瓶，将悬浮细胞液吸出，将该培养液 400 g 离心 4 min，去除上清液，留沉淀物，加入新的培养液，以 5105/ml 细胞密度接种于多聚赖氨酸包被的放有载玻片的 6 孔培养板中，37 ，5% CO2 条件下培养3 d 后，大部分嗅鞘细胞贴壁生长。以后根据情况 3648 h 换培养液。免疫荧光鉴定: P75 与 hoechs
11、t 双染。用明视野和相差显微镜观察，随机选取 5 个视野计数阳性细胞数并计算平均阳性百分率。1.2.2 大鼠脑出血模型的制作：38 只体重 250300 g 的 SD 大鼠随机分成三组：第 1 组 10 只为空白组，第 2 组 10 只为 HBSS 移植组，第 3 组 18 只为嗅鞘细胞移植组（其中 4 只在移植细胞中标记 hoechst，观察细胞在大鼠体内生长情况，4 只用于电镜观察细胞移植后的超微结构） 。模型制作参照 Hua 等3的方法。1.2.3 Hoechst33342 标记 OECs：Hoechst33342 染料是双间二氮茚类物质，其可逆结合于细胞中富含 A-T 的染色体区域，在
12、紫外光激发下产生黄绿色荧光。离心收集好的细胞里加入新鲜 D/F12 培养基 34 ml，移液管反复吹打形成细胞3悬液，加入核荧光标记物 Hoechst，使之作用浓度为 10 g/ml，迅速晃动混匀后移入 37 CO2 孵育箱中孵育 15 min，取少量悬液进行台盼蓝活细胞计数，离心去上清，用 HBSS 液悬浮细胞，调整终浓度为 4104/l 备用。1.2.4 立体定向细胞移植：移植 OECs 细胞悬液的制备:用 0.25%胰酶消化OECs 后，反复 1 0OO r/min 离心 6 min，用细胞计数板计数细胞浓度为4104/l，以 HBSS 液悬浮细胞。在制作大鼠脑出血模型后的第 3 天，注
13、射麻醉，将其置于立体定向架上。碘伏消毒后，沿中线切开缝合线，暴露颅骨。按照实验分组，第 2 组在立体定向下引导微量注射器向大鼠脑组织尾状核内匀速注射(10 min)10l HBSS，第 3 组注射由 HBSS 悬浮的嗅鞘细胞 10l（细胞浓度为 4104/l)，其中 4 只大鼠的嗅鞘细胞标记 Hoechst，注射部位为原手术入口，即前囟右旁 3.0 mm，进针深度为 6.0 mm，当注射 5l 左右，将微量注射器提高 2.O mm 继续注射 5l，注射时间上下部位各 5 min，再分别上下部位各停针 5 min 后缓慢拔出注射器，3% H2O2 清洗创面缝合头皮后，碘酒消毒伤口。1.2.5 神
14、经功能评分：forelimb placing3评分方法：实验人员控制住大鼠的后肢及一侧前爪，使另一侧前爪能自由活动，用能活动侧前爪的触须碰桌沿，共 10 次，记录前爪能抓桌沿的次数，1 次 1 分，最高 10 分。细胞移植后 3 d、7 d、14 d 和 30 d 分别进行 forelimb placing 功能评价。1.3 统计学处理方法 采用单因素方差分析。2 结果2.1 免疫荧光鉴定及纯度计算 免疫荧光鉴定：P75 具有特异性，本实验行嗅鞘细胞的 P75 和 hoechst 免疫荧光双染。嗅鞘细胞根据形态分为梭形细胞、双极细胞、三极细胞、多极细胞及连接成网状的细胞（见图 1、图 2） 。
15、纯度计算：对培养 7 d、14 d 和 21 d 的细胞分别进行纯度计算，各个时间的嗅鞘细胞的纯度是不一样的，培养 7 d 时嗅鞘细胞的纯度最高，可达 80%，以后逐渐下降，14 d 纯度为 70%，21 d 细胞纯度仅为 50%。文献报道称嗅鞘细胞比例达 50%就可以进行细胞移植4，故本实验培养的细胞符合细胞移植的要求。2.2 Hoechst33342 OECs 观察 将移植 Hoechst 标记嗅鞘细胞的大鼠常规灌注，制作冰冻切片。荧光显微镜观察可见大量草绿色 Hoechst 标记的细胞核，证实 Hoechst33342 标记 OECs 在大鼠体内存活，细胞从注射部位向上下迁移并分布于血肿
16、带的附近。分别见图 3、图 4。 2.3 电镜观察 分别将正常大鼠、脑出血模型制作后的大鼠和移植嗅鞘细胞后 3 d、7 d、14 d 和 30 d 的大鼠各 1 只予常规灌注，根据立体定向的方法，取出注射嗅鞘细胞处的尾状核脑组织，送电镜室切片观察，通过对正常脑组织、脑出血后的脑组织、移植细胞后不同时间段的脑组织的比较，观察脑组织超微结构的变化。嗅鞘细胞内有丰富的线粒体、游离核糖体及粗面内质网，细胞质深，细胞核不规则，常染色质为主、核仁编织状，可4见神经微丝，新生的髓鞘较薄、神经丝少，有突触联结，突触囊泡成圆形，周边有红细胞，大堆红细胞被新生的嗅鞘细胞包围，髓鞘边缘有小的囊泡、脂质样颗粒，移植区内毛细血管丰富（见图 5、图 6） 。2.4 三组间神经功能评分比较 在神经功能恢复情况中，空白组和 HBSS 组在术后 30 d 的神经功能缺损评分较术后 3 d 显著降低，差异有显著性(P0.05)，说明对照组也存在自我修复的能力。OECs 移植组在术后 14 d 的评分即有明显降低，差异有显著性(
