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1、1嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞的作用作者：刘志元, 刘锦波, 张志坚, 龚爱华, 张俊【摘要】 目的： 研究体外培养的大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell,OEC)对活化的星形胶质细胞(astrocytes,AST)的作用。方法： 体外培养嗅鞘细胞和星形胶质细胞。星形胶质细胞经纯化传代,细胞融合后利用划伤法得到活化的星形胶质细胞,将嗅鞘细胞与活化的星形胶质细胞共培养 24 h 后,观察星形胶质细胞增殖能力的改变,以及其表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的变化。结果： 活化的星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养后,MTT实验表明其增殖能力增强;
2、免疫荧光染色、RT-PCR 和蛋白质印迹法测定结果表明共培养后活化的星形胶质细胞表达的 GFAP 和 CSPG 降低。结论： 嗅鞘细胞作用于活化后的星形胶质细胞以后,能够促进星形胶质细胞的分裂增殖,同时能够减少星形胶质细胞胶质化,降低抑制性细胞因子的表达。 【关键词】 嗅鞘细胞; 星形胶质细胞; 增殖; 胶质纤维酸性蛋白(GFAP); 硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)Abstract Objective: To study the effect of olfactory ensheathing cells on reactive astrocytes in vitro.Methods： Olfa
3、ctory ensheathing cells and astrocytes were cultured from Sprague Dawley Rats in vitro. Astrocytes were purified then passaged and grown to confluence.Some cultures were scratched to induce a reactive astrocyte phenotype.Olfactory ensheathing cells were added onto confluent astrocytes for 24 h.The d
4、ifferences of cell proliferation,expressions of glial fibillary acidic protein(GFAP) and chondroitin sulfate proteoglycans(CSPG) were measured among the normal group, active group,and the cocultured group. Results： When olfactory ensheathing cells were cocultured with reactive astrocytes,the prolife
5、ration of reactive astrocytes was increased, and a decrease in GFAP and CSPG expression was also observed. Conclusion： After cocultured with reactive astrocytes, olfactory ensheathing cells can promote the proliferation of reactive astrocytes,and reduce the astrocyte gliosis and expression of inhibi
6、tory cytokines.Key words olfactory ensheathing cells; astrocytes; proliferation; GFAP; CSPG脊髓损伤的治疗是临床的一大难题,缺乏有效的治疗方法,因此一直是科研人员和临床工作者关注的重点。嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell,OEC)本身具有促进神经细胞和嗅神经再生的重要功能,而且能够分泌多种神经营养因子和促进神经再生修复的黏附分子1。脊髓损伤后嗅鞘细胞移植有利于轴突的再生,减少组织的丢失,促进运动功能的恢复2-3。2脊髓损伤后由星形胶质细胞(astrocytes,AST)等过度增
7、生的胶质瘢痕是影响轴突再生和功能恢复的主要不利因素。嗅鞘细胞容易与星形胶质细胞混合生长,不会引起后者的肥大以及硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)表达的增加。不仅如此,嗅鞘细胞移植到损伤的脊髓背根后,传入纤维的轴突能够穿越损伤区域的胶质瘢痕到达脊髓,轴突与神经元再次建立功能联系4。Li 等5认为嗅鞘细胞的修复作用尤其是促轴突再生,形成新的传导通路等方面与星形胶质细胞密切相关。嗅鞘细胞是否作用于损伤早期活化的星形胶质细胞,从而减少其增生,减轻胶质瘢痕的形成还不是很清楚。本实验采用体外细胞共培养的方法,排除脊髓损伤后复杂的细胞环境等其他因素干扰,探讨嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞增殖能力、胶质纤维酸性蛋白
8、(GFAP)和 CSPG 表达的影响以及可能机制。1 材料和方法1.1 材 料DMEMF12(11) 、FBS、0.25%胰蛋白酶+0.05%EDTA(Gibco 公司,美国);PolyLlysine(Sigma 公司,美国);兔抗NGFRp75 、小鼠抗人 GFAP、FITC 羊抗兔 IgG、FITC 羊抗小鼠 IgG(购于博士德公司);Hoechst 33342 染色液(购于碧云天);CSPG 单克隆抗体,FITC IgG 二抗(Sigma 公司,美国);MTT 细胞增殖检测试剂盒;插入式培养皿(Millipore 公司,美国)。清洁级 SD 大鼠,17 d 龄,购于江苏大学动物中心。1.
9、2 方 法1.2.1 嗅鞘细胞的分离和培养 取80%。1.2.2 星形胶质细胞的分离和培养 新生 13 d 的 SD 大鼠,取大脑皮质并剥除外膜,0.25%胰酶加 0.05%EDTA 消化,20%FBS 的 DF12 培养基制成细胞悬液,调节细胞密度为 1106,接种于 6 孔板差速贴壁处理 1 h 左右,转入新的 6 孔板中继续培养,3 d 后半量换液,继续培养至细胞融合达到 90%左右。将培养板在 37 恒温摇床中以 180 r/min 振荡 18 h 后,消化传代,转入包被 PLL 的 24 孔板中继续培养,一般 35 d 后即融合。1.2.3 星形胶质细胞的活化 星形胶质细胞融合后,利
10、用枪头制造机械损伤,无血清完全培养基继续培养 24 h 后即得到活化的星形胶质细胞。1.2.4 星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养 嗅鞘细胞大部分融合后,消化,用无血清的 DMEM 制成 1105/ml 密度的细胞悬液。嗅鞘细胞培养上清液通过嗅鞘细3胞融合后加入无血清的 DMEM 培养 24 h 获得。传代星形胶质细胞活化结束以后,将星形胶质细胞分成 4 组,分别为:正常组、活化组、与嗅鞘细胞共培养组(又分直接共培养组和间接共培养组)。其中正常组和活化组加入无血清 DMEM,直接共培养组加入等量的嗅鞘细胞悬液,间接共培养组分为两种方式:24 孔板利用孔径 0.4 m 的插入式培养皿实现;96 孔板使
11、用嗅鞘细胞培养上清液(用于 MTT 实验)。将上述的细胞继续培养 24 h 后进行后续试验。1.2.5 MTT 法检测星形胶质细胞增殖能力 共培养结束后,于 96 孔板中 4 个不同组别每孔加入 10 l 的 MTT 溶液,在细胞培养箱中继续孵育 4 h;每孔加入100 l 的 Formanzan 溶解液继续孵育至深紫色结晶 Formanzan 全部溶解;570 nm 测定光密度值。1.2.6 免疫细胞荧光法检测细胞形态,数量和 GFAP、CSPG 的表达 共培养 24 h 以后,24 孔板 PBS 清洗;4%多聚甲醛固定; 0.5% Triton X100 孵育 2 次; 3%H2O2 处理
12、;含 5%山羊血清的 PBS 溶液中孵育;然后加入小鼠抗大鼠GFAP(1100)和小鼠抗大鼠 CSPG(1200)后室温孵育 1 h;将标本加入荧光 FITC羊抗小鼠 IgG(150),室温暗处孵育 1 h 后,Olympus 荧光显微镜 IX71 观察拍照。对于 GFAP 和 CSPG 以及不同的细胞培养组,分别选取源自不同批次试验的不同培养孔的多个视野的图像进行分析。将图像转换成灰度值,活化组的平均灰度值作为 100 标准值,通过计算不同组别图像的平均灰度值和强度值来半定量分析GFAP 和 CSPG 表达的异同。1.2.7 RTPCR 法检测星形胶质细胞 GFAP mRNA 表达 收集 2
13、4 孔板中的细胞,采用 Trizol(Invitrogen)一步法进行总 RNA 提取。紫外分光光度计测定 RNA 浓度和纯度,D(260 nm)/D(280 nm)在 1.82.0 之间,利用 MMLV 第一链 cDNA 合成试剂盒逆转录合成 cDNA,进一步进行 PCR 扩增。引物由上海生工公司合成。 肌动蛋白及 GFAP 扩增产物大小分别为 250 bp 和 384 bp。PCR 反应条件, 肌动蛋白:预变性 94 5 min,变性 94 30 s,退火 55 30 s,延伸 72 20s,30个循环后 72 延伸 5 min。GFAP:预变性 94 5 min,变性 94 1 min,
14、退火 55 55 s,延伸 72 30 s,30 个循环后 72 延伸 5 min。取 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,利用凝胶成像系统对电泳带进行密度扫描,以 GFAP/ 肌动蛋白比值代表 GFAP 的相对表达量。各组实验至少重复 3 次。1.2.8 蛋白质印迹法检测星形胶质细胞 GFAP 蛋白的表达 收集 24 孔板中的各组细胞,并提取细胞总蛋白。BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取总蛋白各 50 g 进行 SDSPAGE 凝胶电泳后,转移到硝酸纤维素膜上,封闭后分别加入 GFAP、CSPG 和 肌动蛋白抗体(工作浓度 11 000),4 杂交过夜,洗膜以后加入对应 2 抗(工作浓度
15、 13),室温孵育 1 h 后 BeyoECL Plus 显色,于暗室内压片,显影定影。41.3 统计学方法利用 Excel 2003 和 SPSS13.0 软件进行统计学分析,结果以均数标准差(s)表示。组间比较采用单因素方差分析,P80%;星形胶质细胞经过差速贴壁处理和恒温摇床处理以后,细胞纯度高达 90%左右。见图 1。2.2 共培养前后活化的星形胶质细胞的增殖能力与嗅鞘细胞共培养以后,星形胶质细胞的增殖能力增加,与活化组比较差异具有统计学意义(P0.01)。不同共培养方式的作用也存在差异,直接共培养组的作用更明显,差异具有统计学意义(P0.01)。见图 2。2.3 各组星形胶质细胞形态以及 GFAP、CSPG 蛋白的表达在形态上各组的星形胶质细胞无明显区别,见图 3 (A,C,E,G)。与正常组(图3 A,B)相比,活化后的星形胶质细胞(图 3 C,D)表达更多的 GFAP 和 CSPG。与嗅鞘细胞共培养以后,无论是直接还是间接方式,活化的星形胶质细胞表达 GFAP(图 3 E,G)和 CSPG(图 3 F,H)量减少。检测结果表明,活化组的 GFAP 和 CS
