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1、研究报告 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN2013年第6期 氟喹诺酮类（Fluoroquinolones，FQs）药物是一 类重要的广谱抗生素，主要包括环丙沙星（Ciproflo- xacin，CIP） 、恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR） 、沙拉 沙星（Sarafloxaxcin，SAR） 、单诺沙星（Danoxacin， DAN）和达氟沙星（Difloxacin，DIF）等。该类药 物在畜牧养殖中广泛用于预防、治疗动物疾病，但 随之出现了动物源性食品兽药残留问题。动物源性 食品中残留的氟喹诺酮类药物，除了可能对消费者 产生毒副作用外，还容易诱导人类致病菌
2、产生耐药 收稿日期 ： 2013-01-29 基金项目 ： 国家科技支撑计划项目（2012BAF14B00，2012BAF14B02） 作者简介 ： 马寅生，男，副研究员，研究方向 ： 食品安全快速检测技术 ； E-mail ： 通讯作者 ： 万宇平，男，工程硕士，研究方向 ： 食品安全快速检测技术 ； E-mail ： 一种快速检测氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡 配合胶体金试纸卡读数仪使用 马寅生1 万宇平1 刘清珺2 贾芳芳1 张禹1 杜美红2 （1. 北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206 ； 2. 北京市理化分析测试中心，北京 100089） 摘 要 ： 利用胶体金免疫层析技术
3、研制了一种快速检测牛奶中的氟喹诺酮类药物试纸卡，并配合胶体金试纸卡读数仪使用， 结果显示，该试纸卡对恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星的检测 限为 20 g/L， 对依诺沙星、 恶喹酸的检测限为 40 g/L， 检测时间为 10 min， 假阳性率和假阴性率均为 0。该试纸卡能够准确、 可靠、 简便地检测牛奶中残留的氟喹诺酮类药物，适合大量样品的现场检测。 关键词 ： 氟喹诺酮类药物 胶体金试纸卡 胶体金试纸卡读数仪 快速检测 Gold Immunochromatography Assay for Rapid Detection of Flu
4、oroquinolonesBeing Used with a Readout Instrument of Colloidal Gold Test Paper Card Together Ma Yinsheng1 Wan Yuping1 Liu Qingjun2 Jia Fangfang1 Zhang Yu1 Du Meihong 1 （1. Beijing Kwinbon Biotechnology Company，Beijing 102206 ； 2. Beijing Centre for Physical & Chemical Analysis，Beijing 100089） Abstra
5、ct: To establish a rapid assay for detecting fluoroquinolones in milk, gold immunochromatography assay was studied, which was used with a readout instrument of colloidal gold test paper card together. The limit of detection（enrofloxacin, sarafloxaxcin, difloxacin, ofloxacin, norfloxacin, ciprofloxac
6、in, pefloxacin, flumequine, danofloxacin）is 20 g/L, and（enoxacin, oxolinic acid）is 40 g/L. We can obtain the results in 10 minutes. The assay gives no false positive and false negative results. The method is accurate, simple, reliable and convenient to rapidly detect fluoroquinolones of a lot of sam
7、ples on the spot. Key words: Fluoroquinolones Gold immunochromatography assay strip Feadout instrument of colloidal gold test paper card Rapid detection 性1。另外，我国是动物源性食品出口国，多年来 因药残问题加大了农畜产品出口的国际市场压力。 目前测定动物组织中氟喹诺酮残留量的定性检 测技术有微生物法、荧光分光光度法、酶联免疫分 析法等 ； 定量检测技术有高效液相色谱法、液相色 谱 - 质谱联用法，还可采用毛细管区带电泳和毛细 管胶束电动色谱
8、法等2-4。农业部在第 236 号公告 45 中发布了动物性食品中恩诺沙星、环丙沙星、嗯 喹酸和氟甲喹的残留检测方法，其它 FQs 标准检测 2013年第6期227 马寅生等 ： 一种快速检测氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡配合胶体金试纸卡读数仪使用 方法尚未规定。 在现有的快速检测方法中，我们发现胶体金免 疫层析试纸卡法具有灵敏度高、检测时间短、携带 方便、操作简单及可进行现场操作等特点5，因此， 本研究对氟喹诺酮类药物胶体金快速检测试纸卡进 行了探索和研制，并配合胶体金试纸卡读数仪使用， 在食品安全领域，可以通过数据线将存储的试纸卡 检测数据上传到带无线网卡的笔记本电脑 ； 笔记本 电脑通过无
9、线网络上传到总服务器 ； 政府部门监控 室和（企业）主监控室可以通过软件查看服务器中 的数据库。 1 材料与方法 1.1 材料 氯金酸购自美国 Sigma 公司，柠檬酸三钠、碳 酸钾购自广州化学试剂厂，诺氟沙星、双氟沙星、 恩诺沙星、 氟甲喹、 沙拉沙星、 达氟沙星、 培氟沙星、 奥比沙星、 麻保沙星、 环丙沙星、 依诺沙星、 氧氟沙星、 噁喹酸、洛美沙星标准品购自中国兽医药品监察所。 硝酸纤维素膜（NC 膜） 、玻璃纤维、样品垫及吸水 纸购自上海捷宁生物技术有限公司，XYZ 3000 平台 系统、试纸卡切刀购自美国 Biodot 公司，冻干机购 自北京松源华兴生物技术有限公司，紫外可见光分
10、光光度计购自 Eppendorf 公司，冷冻离心机购自湖南 湘立科学仪器有限公司，磁力搅拌加热器购自河南 圣亚仪器仪表有限责任公司，胶体金试纸卡读数仪 GT01 来自北京勤邦生物技术有限公司。 1.2 方法 1.2.1 氟喹诺酮类药物 -载体蛋白偶联物的制备 将 诺氟沙星1 mmol， 溶于15 mL三氯甲烷中， 加入N， N - 二环己基碳二亚胺（DCC）2 mmol，4-二甲氨基吡啶 （DMAP）催化剂适量，氨基丙酸叔丁酯 1.5 mmol， 室温搅拌 5 h， 薄层色谱（TLC）监测原料消失， 过滤， 将液相水洗， 无水 Na2S2O4干燥， 柱层析纯化 （洗脱剂， 乙酸乙酯 / 石油醚
11、， 1/5） 。将上述产物溶于冰醋酸中， 室温搅拌 2 h，TLC 监测原料消失，减压脱溶剂，将 得到的粘稠物溶于 1mol/L NaOH 溶液，调节 pH3-5， 乙酸乙酯萃取，干燥，柱层析纯化（洗脱剂，乙酸 乙酯 / 石油醚，1/1） ，得氟喹诺酮类半抗原，见图 1。 利用混合酸酐法，将诺氟沙星半抗原偶联到卵清蛋 白上，制备成包被原和免疫原。 1.2.2 氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备 用上述 制备出的免疫原（FQS-BSA）进行动物免疫，获得 稳定分泌抗氟喹诺酮类药物单克隆杂交瘤细胞株 D-3-1，该细胞株已于 2012 年 03 月 12 日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生
12、物中心（简 称 CGMCC） ，保藏登记号为 CGMCC NO.5885。 1.2.3 抗体效价测定 采用间接 ELISA 法测定氟 喹诺酮类药物单克隆抗体效价，将包被抗原按 2.5 g/mL 包被酶标板，将酶标氟喹诺酮类药物单克隆 抗体按 11 000、 12 000、 14 000、 18 000、 1 16 000、132 000、164 000、1128 000 的倍数 进行稀释，进行效价测定。 1.2.4 抗体特异性鉴定 选择不同的氟喹诺酮类药 物（诺氟沙星、双氟沙星、恩诺沙星、氟甲喹、沙 拉沙星、 达氟沙星、 培氟沙星、 奥比沙星、 麻保沙星、 环丙沙星、 依诺沙星、 氧氟沙星、
13、噁喹酸及洛美沙星） 进行 ELISA 测试，测定标准曲线，并计算 IC50 抑制 浓度，计算交叉反应率。 1.2.5 氟喹诺酮类药物单克隆抗体 - 胶体金标记物 的制备 1.2.5.1 胶体金的制备 用双蒸去离子水将 1% 氯金 酸稀释成 0.01%（质量百分含量） ，置磁力加热棒搅 拌器上搅拌煮沸，每 100 mL 0.01% 氯金酸加入 2.5 mL 1% 柠檬酸三钠，继续搅拌加热反应至液体呈红 色时停止加热，冷却至室温后补足失水。 1.2.5.2 氟喹诺酮类药物单克隆抗体 - 胶体金标记 物的制备 以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用 量比例， 用 0.2 mol/L 的碳酸钾调节胶体金溶
14、液至 7.2， 将抗体用 pH7.6，0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液逐级稀 释为 5-40 g/mL，各取 0.1 mL 按顺序加入一系列装 有 1 mL 胶体金的试管中，5 min 后在上述试管内分 别加入 0.1 mL 10% 氯化钠，混匀，静置 2 h 后观察 图 1 半抗原合成线路图 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2013年第6期228 够有效避免人为判读误差以及结合物联网技术可以 实时在线监测。 本研究使用的是胶体金试纸卡读数仪。该胶体 金试纸卡读数仪的尺寸为 23012090 mm，重量 约为 1 kg，具有 5 个按键（电源键、重置键、打印 键、选
15、项键、确认键） ，读数速度为 7 s，读数精度 ： CV2%，有内置电池，可以外接打印机，能够检测 三聚氰胺、磺胺类药物、沙丁胺醇等 13 种以上的项 目种类，卡条、裸条均可读取，具有 2GB 的 SD 卡， 可以储存 100 万条以上的数据，可配套物联网及数 据库系统，实现数据远程传输和监控。使用时，将 显色后的试纸卡插入胶体金试纸卡读数仪，经过发 色以及逐行叠加，就会测出数值，进而用测得的数 值推导浓度值。 从软件中的主服务器界面点开子服务器的图标 可以查看子服务器中的检测数据 ； 子服务器界面中 的信息包含有 ：检测日期、检测时间、样本编号、 实验员、检测项目、检测值及红绿指示灯 ； 如
16、果出 现红色指示灯则说明该样本药物超标，系统会给政 府部门负责人发出警报，见图 3。 结果。 1.2.5.3 试纸的组装 将所述样品垫、胶体金结合 垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在所述底板上， 见图 2，在组装好的试纸固定于卡壳。 图 2 试纸卡示意图 1.2.6 试纸卡检测试验 1.2.6.1 灵敏度试验 将恩诺沙星、沙拉沙星、双 氟沙星、 氧氟沙星、 诺氟沙星、 环丙沙星、 依诺沙星、 培氟沙星、氟甲喹、恶喹酸及达氟沙星标准品稀释 成如下不同浓度 ： 0、10、20 及 40 g/L（恩诺沙星、 沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙 沙星、培氟沙星、氟甲喹及达氟沙星） ； 0、20、40、 80 g/L（依诺沙星、恶喹酸） ，所用的稀释液为 pH 为 7.2、0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液，用试纸卡进行测 试，各做 3 个重复。 1.2.6.2 特异性试验 特异性常用交叉反应率表示， 是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。
