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1、Selective analysis of histamine in food by means of solid-phase extraction cleanup and chromatographic separation通过固相清理和色谱分离提取分析食品中的组胺摘要为了选择性测定和测定测定发酵食品中的组胺含量我们提出了一个简单、实用的技术。该方法涉及包括使用 SepPak Plus C-18 盒进行固相萃取清理和离子配对反相高效液色 (IP-RP-HPLC)分离，其次是在紫外线吸收波长为 220nm 处检测组胺。蒸发浓缩从食物样本中的甲醇提取物后，由此产生的残渣用 0.2 M 的磷酸盐缓
2、冲(pH 值 3.0)重新溶解，随后通过盒。从盒中出来以后的在 C-18 列用 IP-RP 模式下进行色谱分析，作为固定相，用0.2M 磷酸缓冲(pH 值 3.0)-乙腈 -水(1:24:166, v/v)溶液，包含 2mM。松藻属于 1 辛烷磺酸，是作为流动相。当这种方法应用于组胺、尸胺(Cad)、腐胺(Put) 、5 -羟色胺(5HT)和酪胺(酪氨酸 Tyr)的混合物，只有组胺的保留时间是 16.4 分钟。该方法充分验证和验证参数：线性范围 2 - 1000 ppm；相关系数 0.991；平均回收率 99.5%；限制量化 2 ppm 和限制检测 0.5 ppm。该方法应用于 12 个品牌的
3、味噌( 发酵豆瓣酱 )，9 个品牌的清酒(米酒)，和5 品牌的 Shouyu(日本酱油)，来验证检测各种发酵食品中组胺的能力。这种方法被证明既快速又准准确，因此建议用于组胺污染调查和日常实践的食品质量控制中。1、介绍众所周知，过敏如食物中毒和组胺(HA)中毒似乎主要是由组胺引起的，这是酶促降解氨基酸组氨酸产生的,通常食物本身中就有1。一般来说，组胺中毒是由于摄取相关种的未加工、冷冻或罐装鱼，例如竹荚鱼等2、琥珀鱼3和鲭鱼4，除了金枪鱼5 - 7和鬼头刀鱼8。另一方面,组胺是可食用的鱼类产品质量控制的其中一个“生物标记”。组胺测试可能是一个在 HACCP 计划中可以使用于海鲜的控制策略。根据合规
4、政策指南# 540.525(联邦公报 ,1995)9,质量好的鱼含有少于 10 ppm 组胺，组胺水平达到 30 ppm 表明鱼肉质量显著恶化，组胺含量为 50 ppm 时被认为是鱼肉被分解的确凿证据。直到现在，已经有许多种方法来阻止食品产生组胺：酶10、11 ，免疫学12和色谱13。高效液相色谱仪(HPLC)是最可靠的技术之一，通常应用于鱼和相关类型的样品。在样品是鱼时，妥善进行高效液相色谱在提取组胺时可以给出很好的分析结果，且不需要任何进一步的清理。虽然众所周知相对较高浓度的发酵食品中含有组胺，关于食品中含有组胺的调查报告也只有在最近才公布出来。在做这些调查时我们有时会遇到一个问题，就是当
5、用高效液相色谱方法分析日本的发酵食品样品发现其中含有许多成分。在这种情况下，众多的峰值对应于这些成分有时会干扰组胺峰值的界定。去除这些化合物通常需要用离子交换柱色谱法14经过 2 或 3 小时的“ 清理”。 根据在本文中的报道，我们开发了一个简单、快速、非常具体、实用的技术用来分析发酵食品中的组胺：通过 Sep-Pak Plus C-18 装前分析清理、离子配对 (IP)逆转-相高效液相色谱法(RP) 和紫外检测。2、材料和方法2.1 试剂和材料组胺和其他试剂采购均从 Wako 化学有限公司，东京( 日本)，最高级别的高效液相色谱-级采用商用，被使用在没有进一步的提纯阳离子中。所有准备水溶液的
6、水使用 Milli-Q净化系统净化的水(Millipore, Milford,MA, USA)。在这项研究中，我们通过用水溶解使浓度为 1 毫克组胺/ 100 毫升溶液制备了组胺标准溶液,与食品样本中组胺的浓度 100 ppm 对应。一个五个组件生物胺标准溶液包括组胺、尸胺(Cad)、腐胺(Put) 、5 -羟色胺(5HT)和酪胺(酪氨酸 Tyr)，是用水或 0.2M 磷酸盐缓冲(pH 值 3.0) 溶解，使胺浓度在任何一种情况下都为 1 毫克/毫升。日本发酵食品、清酒、味噌、Shouyu 可以在当地食物商店购买到。2.2 高效液相色谱仪高效液相色谱系统由一个智能 pu - 980 泵(Jas
7、co、东京、日本 )，用于高压权力平等的模式洗脱。一个 20- l 样品加载有 Rheodyne 注射器加载阀 (Reodyne, CA, USA)与 20- l 注射试样循环或 50- l 微升注射器 (Hamilton, Hamilton Company, Reno, NV, USA)。分析柱是 Asahipak ODP-50 (1506.0 inner diameter; Showa Denko K.K., Tokyo,Japan)。柱形物维持在 45 C in a CO-965 柱温箱 (Jasco)。一个流动相，0.2M 磷酸盐缓冲剂(pH3.0)乙腈水(1:24:166,v / v
8、)，它包含一个离子配对试剂、2Mm 辛烷磺酸钠，脱气是通过 aDG-980-51 在线脱气器 (Jasco)。柱形物废水监测是在 220nm 用 821 - UV 紫外线(UV)吸收检测器(Jasco)。洗脱液的流量的是 1.0 ml / min。采用智能数据处理器 807-IT (Jasco) 对所有的色谱数据进行印刷。2.3 发酵食品提取的准备发酵食品样品提取物制备的称重，从一部分食物中称取 5.0 克放进均质化帽，与 40 毫升的甲醇一起均质化。进过甲醇稀释后体积为 50 毫升，然后用离心机用 2000 r.p.m.离心10 分钟。移取 10 毫升上清液到圆底蒸馏烧瓶中，在真空中蒸馏。然
9、后，产生的残渣用 10毫升 0.2 m 磷酸盐缓冲 (pH 值 3.0) 洗，随后用直径为 0.45 米的一次性注射器过滤器单元过滤(DISMIC-13cp, Advan-tec Toyo, Tokyo, Japan)。在使用 Sep-Pak Plus C-18 盒(Waters Co., Milford, MA, USA)前，盒用 5 毫升甲醇冲洗一次再用 5 毫升的水冲洗两次。然后 1.5 毫升的滤液通过盒，洗脱液收集在一个 1.6 毫升量的带平顶帽的聚丙烯微型离心管中。这个样品在高效液相色谱分析组胺前是存储在冰箱中。3、结果和讨论在先前的文章中，我们报道了用在柱衍生毛细管电色谱(CEC)
10、选择性检测食品样品中的生物胺，包括组胺、尸胺、腐胺、5 -羟色胺和酪胺。随后,一个简单的组胺检测设备能够检测到组胺但并不包括其他生物胺和氨基酸，这被我们团队应用于检测变质的鱼 16。在对于组胺研究的这个阶，我们开发了一个简便分析某些日本发酵食品的组胺水平的优化技术，如下所述。3.1 IP-RP-HPLC（反相高效液相色谱法的优化）参照八木天线发表的文献17 ，我们检查了论文中乙腈试剂离子浓度的影响、离子纸试剂和流动相的 pH 值等来自其它移动相的性能的反相高效液相色谱法分离组胺。基于这些实验的结果，我们选择高效液相色谱条件和考虑这两个保留时间和峰的形状，并在实验摘要中描述了组胺。3.2 用 S
11、ep-Pak Plus C-18 和清洗一个 Sep-Pak Plus C-18 盒在这项研究下的作用是从食物提取物中去除尽可能多的不良成分。首先，标准溶液的五个组件生物胺通常发现在发酵食品中，对其用 IP-RH-HPLC和紫外检测器(220nm)进行分析。如图 1A 所示，是一个典型的色谱图。 酪氨酸、5 -羟色胺和组胺分别在 9.13、10.85 和 16.4 分钟的时候被洗脱。然而由于其他如烷基胺、尸胺和腐胺等的吸光度值低于 220nm 而没有被发现。水性标准胺通过 “清理”，随后，其解决方案是出来的盒用同样的方式来衡量。没有观察到高峰，因为所有胺被保留在盒内然后，溶剂标准的生物胺溶液用
12、水替代了 0.2M 磷酸盐缓冲溶液是为了使溶液 pH 值为 3。( 数据未显示)。然后，如上所述同样的程序进行。结果显示于图 1 B：观察到只有主要的峰对应于组胺。这个结果表明，目前的清理技术是非常有效的，可以应用于选择性分析食品中的组胺。3.3 清理程序应用于发酵食品当发酵食品中的一个样本与甲醇同质化后，大量的亲水性化合物，如脂质等一起被水溶性材料提取，包括组胺。在那之后，甲醇的提取物蒸发至干燥，和随后用 0.2 磷酸盐缓冲剂重新溶解(pH 值为 3.0)；然后，一些疏水性化合物，这是主要的组件，沉淀出来后被过滤。当一个整除的滤液通过通过 Sep-Pak Plus C-18 盒时，大多数疏液
13、化合物在该情况下是保留在盒内，但是亲水性化合物和组胺不保留，因此，就通过了通过盒。最后,一个整除的解决方案，该解决方案是通过使用 IP-RP-HPLC 检查盒，大多数的亲水性化合物首先从这个 C-18 柱形物上洗脱下来。只有阳离子亲液成分，如组胺，与离子缩减试剂和胺耦合而被保留在柱形物上。从日本米酒样品中发现了一个组胺的代表色谱，但随后在清洗盒前发现组胺的浓度飙升至 20 ppm，在图 2A 中显示。可以从图中看到，许多峰甚至出现在洗脱时间为 20 分钟后。组胺对于的峰在 16.4 分钟，但由于重叠不能被发现。相比之下，当同一样品接受盒只有组胺的峰的洗脱时间被观察到为 16.4 分钟，如图 2
14、B。在洗脱时间16.4 分钟周围的山峰用目前的方法是完全消除的,和组胺对应的峰是很容易识别的色谱。3.4 从 Sep-Pak Plus C-18 盒中恢复首先，通过在一个日本米酒中添加 100 ppm 的组胺来测试其对组胺从 Sep-Pak Plus C-18 盒中恢复的样品溶液体积的影响。对于味噌样品，用与日本米酒同样的试验。两个实验的结果如图 3 所示。根据这些结果，发现至少 1.5M 的样品溶液通过盒才能恢复最多的组胺。接下来，在最优条件下，在样品中掺入浓度为 10、 100 和 500 ppm 的组胺，分别进行测试，并且他们的结果都显示在图 4。组胺恢复量在 101.3%和 99.5
15、之间是艾克塞琳指标，该方法可以成功地应用于准确测定食品中组胺。3.5 验证的方法所有的验证测试的方法实现都是在食品中使用组胺，如味噌和日本米酒，都是通过添加组胺的浓度。每个再现性值分析是通过计算峰面积及保留时间，得到了从五个相同的高效液相色谱法试验。再现性对峰面积及保留时间在这两种情况下，即味噌和日本米酒，分别小于 1.33 和 0.15%的中心值 (C.V.)。每个线性测试通过峰面积响应也是通过使用每一种食物样品中不同浓度水平来分析评估的，组胺的浓度介于 2 和 1000 ppm。味噌和日本米酒的线性的结果显示分别为 0.991 - -0.994 的系数因素。量化的限制浓度是 2 ppm。检
16、测极限的组胺的信噪比(S/N)在两食品样品中是一样的，为 0.5 ppm。为了提高检测灵敏度，日本米酒 10 毫升的甲醇提取物(20 ppm 组胺) 经过蒸发，产生的残渣用 2 毫升 0.2 M 磷酸盐缓冲(pH 值 3.0)重新溶解。这个解决方案有一个组胺浓度为高于实验五倍。其次,解决方案是通过盒，一个整除的解决方案，该解决方案出来的墨盒是直接注入当前的 IP-RP-HPLC，但峰共同回应的组胺形状规并不规整，见图 5。在这种情况下，在浓度高于实验五倍的样品溶液同时含有组胺和不需要的化合物。部分洗脱的组胺可能是由于和组胺和不需要的化合物部分抑制形成离子配对形成高度集中的化合物。其解决方案是分别用稀释的二、三、四、五倍的 0.2M 磷酸缓冲(pH 值 3.0)通过盒，组胺的峰的形状变得越来越尖锐如图5B-E 所示。因此,组胺的洗脱在图标 5A-D 中，是不完整的。虽然这项试验通过在溶液中添加组胺的浓度来提高灵敏度的并不成功，检测水平浓度 0.5ppm 的组胺在 22
