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1、药学论文-鸡血藤总黄酮的提取及对羟自由基的清除作用研究作者：黄锁义 罗建华 张丽丹【摘要】 目的探讨鸡血藤总黄酮的提取、鉴别及对羟自由基的清除作用，以充分利用鸡血藤植物资源，避免资源的浪费。方法采用超声波乙醇浸提法从鸡血藤中提取黄酮类物质，对所提取的黄酮类物质进行验证，并用分光光度法测定含量，用鸡血藤总黄酮对羟自由基清除作用进行试验。结果测得样品中总黄酮的含量 C=0.3167mg/ml，回收率为 99.94%，其纯度和产率均较高。结论 该方法采用全物理过程，无任何污染，是提取鸡血藤黄酮类物质的有效途径。鸡血藤总黄酮提取液对 Fenton 体系产生的OH 自由基有很好的清除作用。 【关键词】
2、超声波提取 鸡血藤 总黄酮 自由基Abstract：Objective In order to make use of the resources of Spatholobus suberectusdunn,avoid wasting, the extraction of total flavanone of Spatholobus suberectusdunn and its effects on scavenging of hydroxyl radicals were researched.MethodsThe flavonoids were extracted by ethanol as
3、 the solvent from Spatholobus suberectusdunn with ultrasonic wave and ethanol extraction. The flavanone of Spatholobus suberectusdunn was extracted and ckecked using spectrophotometryThe effect of extracts on Spatholobus suberectusdunn scavenging of hydroxyl radicals was studiedResultsThe density of
4、 the total flavanone of Spatholobus suberectusdunn was C=0.3167 mg/ml and the rate of recovery was 99.94%.ConclusionThis method is a purely physical process and has not any pollution. It is an ideal way to extract the flavanone of Spatholobus suberectusdunn. Total flavanone from Spatholobus suberect
5、usdunn have effects on scavenging of hydroxyl radicals.Key words：Ultrasonic wave treatment； Spatholobus suberectusdunn； Total flavanone; Identification； Free radical 鸡血藤为传统中药，中国药典2000 年版部收载鸡血藤为豆科植物密花豆 Spatholobus suberectusdunn 的干燥藤茎，其性温，味苦、甘，归肝、肾经，有补血、活血、通络的功效，用于月经不调、血虚萎黄、风湿痹痛等症1。现代药理研究表明2：鸡血藤具有降血压
6、、抗癌、抑菌、抗放射线的功效。近年来临床上常用鸡血藤治疗贫血以及各种原因引起的白细胞、血小板、红细胞等全血象减少和再生障碍性贫血等疾病，具有较好的疗效2。目前国内外对鸡血藤总黄酮提取的研究还相当的缺乏。黄酮类有效成分对治疗冠心病、老年性痴呆、脑血栓、神经系统疾病和消除自由基、抑菌、抗癌等方面有显着效果，无副作用，并以此开发出多种药品和保健食品3。目前有文献报道用乙醇提取法4对鸡血藤总黄酮进行提取，但该方法操作繁琐且其提取率很低。近年来，超声技术应用于提取植物中的生物碱、苷类、生物活性物质、动物组织浆的毒质等研究已有报道5，6，表明其具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。很多研究表明，利用超
7、声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等，可加速植物材料中的有效成分进入溶剂，从而增加有效成分的提取率，缩短提取时间，并且还可避免高温对提取成分的影响6，但超声技术应用于提取鸡血藤中黄酮类物质的研究尚未见报道。为此，本文报道用超声波乙醇浸提法提取鸡血藤总黄酮、鉴别及提取物总黄酮对羟自由基的清除作用。现报道如下。1 仪器与试剂1.1 仪器 KQ5200DB 型数控超声波清洗器（超声工作频率 40 KHz、江苏省昆山市超声仪器有限公司）；UV-755B 紫外可见分光光度计（上海分析仪器总厂）；ZF-I 型三用紫外分析仪(上海顾村光电仪器厂)；SHB-III 循环水式多用真空泵（郑
8、州长城科工贸有限公司）。1.2 试剂 95%乙醇 AR；亚硝酸钠 AR；硝酸铝 AR；氢氧化钠 AR；三氯化铝AR；盐酸 AR；氨水 AR；冰醋酸 AR；醋酸乙酯 AR；乙酸镁 AR；甲醇 AR；镁粉AR；正丁醇 AR；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；双氧水 AR；硫酸亚铁 AR；水杨酸 AR；新鲜鸡血藤采自广西百色市。2 方法与结果2.1 总黄酮成分提取取新鲜鸡血藤，烘干，粉碎。称取鸡血藤粉末 6 g，加 80 ml 95%乙醇，超声波提取 2.5 h，抽滤。滤渣再加 80 ml 95 %乙醇，超声波提取 2.5 h，抽滤，合并两次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩 57 ml 左右为止，放
9、置 100 ml 容量瓶中，用 60%乙醇稀释至刻度，得样品液。2.2 测定方法依据以芦丁为对照品测定鸡血藤中总黄酮的含量，加入铝离子试剂，同时控制适宜 pH 值，使黄酮化合物与铝盐形成络合物，在可见光区能获得稳定的特征吸收峰。2.3 定量实验-总黄酮的含量测定2.3.1 波长的选择取样品液适量，在 0.30 ml 5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在 420700 nm 波长范围测定络合物的吸光度，络合物于 510 nm 波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。2.3.2 标准曲线的绘制分别精密吸取芦丁对照液（0.10 mg/ml）0.00，0.50，1.00
10、，2.00，3.00，4.00，5.00 ml 于 10.00 ml 容量瓶中，分别加入 5%亚硝酸钠溶液 0.30 ml，摇匀，静置 6 min；再加 10%硝酸铝溶液0.30 ml，摇匀，静置 6 min；再加 4%氢氧化钠溶液 4.00 ml，用 60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置 12 min，以试剂作空白参比液，于 510 nm 处测吸光度。结果见表 1。表 1 紫外可见分光光度计测定芦丁对照液吸光度结果（略）根据上表得回归方程：A=-0.031 1+13.518 4C，r=0.999 9。2.3.3 提取物含量的测定精密吸取样品液 0.50 ml，置 10 ml 容量瓶，按标准曲线的
11、制备方法测定吸光度 A=0.183，根据回归方程：A=-0.031 1+13.518 4C，计算样品中总黄酮的含量 C=0.3167 mg/ml。2.3.4 回收率实验精密量取样品液 1.00 ml，加入标准芦丁对照品 1.00 ml（0.10 mg/ml），同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为 99.94% 。2.4 定性实验-总黄酮的鉴别2.4.1 颜色反应紫外光下呈色反应：取该样品溶液点在滤纸上，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。浓氨水反应：取该样品溶液点在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏 30 s，立即在紫外光下观察，呈极明显的黄褐色荧光斑点。三氯化铝反应：取样品溶
12、液点在滤纸上，滴加三氯化铝乙醇溶液，吹干。在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。乙酸镁反应：取样品溶液点在滤纸上，滴加 1%乙酸镁甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黄色斑点。盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液 1 ml 于试管中加镁粉，再加入浓盐酸数滴（1 次加入），在泡沫处呈紫红色。2.4.2 纸层析取样品溶液 10 l 点在滤纸上。用正丁醇醋酸水=415（体积比）为展开剂，上行展开 5h，取出晾干。喷 1%氯化铝乙醇溶液。吹干后于紫外光下，可见荧光斑点。2.5 总黄酮提取物对OH 清除作用参照 Fenton 反应的方法建立反应体系模型7，利用 H2O2 与 Fe2+ 混合产生OH，但由于OH 具
13、有很高的反应活性，存活时间短，若在反应体系中加入水杨酸，就能有效地捕捉OH，并产生有色产物。反应式如下：H2O2+ Fe2+Fe3+OH+OH-该产物在 510 nm 处有强吸收，若在此反应体系中加入具有清除OH 功能的被测物，便会与水杨酸竞争OH，从而使有色产物生成量减少，采用固定反应时间法，在相同体积的反应体系(8.8 mmol/L H2O2 1 ml，9 mmol/L Fe2+1 ml，9 mmol/L 1 ml 水杨酸-乙醇溶液)加入一系列不同浓度的鸡血藤总黄酮提取液，并以蒸馏水为参比，与试剂空白液比较，在 510 nm 处测定各浓度下的吸光度，便能测定被测物(总黄酮)对OH 的清除作
14、用，其清除率计算公式：清除率()=A0-AxA0100%以实验的提取液总黄酮作为样品，分别取不同体积的样品定容到 50 ml 分别测其对OH 的清除作用。从图 1 中可看出，鸡血藤总黄酮提取液对由 Fenton体系产生的OH 有很好的清除作用，随着鸡血藤总黄酮提取液浓度的增加，对OH 自由基的清除能力也增强，说明当黄酮类物质的浓度增加时，其清除率也增大。图 1 鸡血藤总黄酮提取液浓度与自由基清除率的关系（略）3 讨论实验结果表明，本实验方法工艺简单，回收率为 99.94%。利用本实验所提供的超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯度较高。超声波可以强化乙醇浸提法，达到省时、高效、节能的目的，
15、此方法采用全物理过程，无任何污染，是一条理想的提取黄酮类物质的途径，具有广阔的应用前景。黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具有很高的药用价值。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等3。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其它脏器细胞的功能。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌、抗病毒、抗
16、氧化、抗衰老、抗辐射等作用8，9。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。鸡血藤分布广泛，本文实验结果表明，鸡血藤中含有较为丰富的黄酮，其提取物总黄酮对羟自由基具有很好的清除作用。因此，鸡血藤有广泛的开发和利用价值，值得综合利用，加强资源开发。【参考文献】1 严启新，李 萍， 胡安明鸡血藤的化学成分研究J中草药，2003，34（10）：876.2 崔艳君 ，刘 屏，陈若芸鸡血藤有效成分研究J中国中药杂志，2005，30（2）：121.3 夏杏洲，张 辉，魏传晚.榕树叶中黄酮类化合物的提取条件研究J.食品研究与开发,2002,23(5):35.4 余燕影,彭志兵,曹树稳.紫外分光光度法测定丰城鸡血藤中总黄酮J.中草药，2005,36(11):1650.5 刘祥义
