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1、核酸,概论 核酸的结构 核酸的理化特性 核酸的研究方法,核酸的发现及研究简史,1868年 F. Miescher 1953年，Watson&Crick,核酸的发现,早期研究,DNA双螺旋结构的建立,生物技术,人类基因组计划,1944年，O.T.Avery的细菌转化,证明DNA是遗传物质,52年，噬菌体感染大肠杆菌实验 证明DNA是遗传物质,核酸的种类及分布,DNA为双链结构，含D-2-脱氧核糖，碱基为ATGC； RNA为单链结构，含D-2-核糖，碱基为AUGC； DNA：主要在细胞核中，是染色体的主要成分。此外在线粒体、叶绿体、质粒及细胞膜上. RNA：细胞核核仁； 细胞质核糖体及上清液中,核
2、酸的生物功能,1. DNA是主要的遗传物质 2. RNA参与蛋白质的生物合成 3. RNA具有多种功能：1）控制蛋白质的合成；2）作用于RNA转录后加工和修饰；3）基因表达与细胞功能调节；4）生物催化与其它细胞持家功能；5）遗传物质信息的加工和进化,核酸结构,RNA：AGCU DNA：AGCT RNA：D-核糖 DNA：D-脱氧核糖,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,碱基,核苷酸结构,核苷酸,1. 碱基 嘌呤碱 嘧啶碱 稀有碱基：大多为甲基化碱基，在tRNA中含量较高； 2. 糖苷：戊糖与碱基以糖苷键（N-C键）连接 3. 核苷酸：,碱基,碱基,核苷,核苷：戊糖与碱基缩合而成，并以糖苷键相连接。
3、 糖苷键： 二者的连接是C-N键，称N-糖苷键。,核苷的表示,核苷：A、G、 C 、U 脱氧核苷：dA,dG,dC,dT 修饰核苷： 5-甲基胞嘧啶：m5dC。,脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,核苷酸,核苷酸是核苷的磷酸酯； 生物体内的游离核苷酸多为5-核苷酸（在核苷左侧加p表示，如pA，右侧则为3-核苷酸）；,核苷酸,各种核苷三磷酸如ATP、CTP、GTP、UTP是体内RNA合成的直接原料，脱氧核苷三磷酸为DNA合成的原料；在生物体的能量代谢中发挥作用 腺苷酸是一些辅酶的结构成分（NAD+、NADP+ 、FAD、FMN） cAMP、cGMP：某些激素发挥生理作用的媒介物，为激素的第二信使。,DN
4、A的结构,一级结构 二级结构（见图） 双螺旋结构模型（1953, Watson & Crick） DNA双螺旋的构象类型 三级结构,核苷酸的连接方式,核酸的基本单位是核苷酸 核苷酸的连接键是3,5-磷酸二酯键，由相间排列的戊糖和磷酸构成核酸大分子的主链，而碱基则是有次序连接在主链上的侧链基团（见图） 核酸一级结构 简写式表示核酸的一级结构：pApCpGpU,核酸共价结构的表示方法,RNA的一级结构,RNA：无分支的线型多聚核苷酸，以3,5-磷酸二酯键连接 tRNA：由73-93个核苷酸组成，含较多稀有碱基（10-15%） 增加识别和疏水作用；3端为CCA rRNA：5S、16S、23S（细菌）
5、；5S、5.8S、18S、28S（哺乳动物） mRNA：原核生物（多顺反子）、真核生物（单顺反子）,单顺反子mRNA和多顺反子mRNA,mRNA,原核生物：多顺反子（一条mRNA上有多个编码区，5和3端有非翻译区） 真核生物：5端-帽子结构；5非编码区、编码区、3编码区、3端聚腺苷酸,真核生物mRNA结构特点,3末端有polyA结构：与mRNA从核入质有关，与mRNA 半寿期有关。 5末端有帽子结构：G被甲基化，此可能与pro合成的起始有关。,高级结构：Chargaff规则,A=T G=C A+C=G+T（含氨基的碱基总数等于含酮基的碱基） A+G=T+C（嘌呤总数等于嘧啶总数）,双螺旋结构模
6、型（ Watson & Crick 模型）,1. DNA分子是由两条方向相反的平行多核苷酸链构成，两条链的主链都是右手螺旋，螺旋表面有大沟和小沟； 2. 碱基均在主链内侧，A与T配对，G与C配对，依靠碱基之间的氢键结合在一起，“半保留复制” 3. 成对碱基处于同一平面，与螺旋轴垂直，双螺旋的平均直径为2nm，核苷酸之间的夹角为36度，每转1周有10个碱基对，螺距为3.4nm； 大多数天然DNA属双链DNA； 双链DNA分子较硬，呈比较伸展的结构。,DNA的二级结构,Dickerson模型,碱基的夹角为2842度，一螺周含10.4个碱基对，螺旋直径为2.37nm 碱基对为螺旋桨状扭曲 提高碱基堆
7、积力,几种DNA钠盐,B-DNA：生理状态下多为此种；92%相对湿度 A-DNA：右手螺旋；75%相对湿度；生理状态 下多见末端RNA、DNA-RNA Z-DNA：人工合成、左手螺旋；嘧啶、嘌呤交 替；有m5dC ；与基因表达调控有关； 此外，还发现有C、D、E等型。,几种DNA构象,三股螺旋DNA的碱基配对,H-DNA: 三条链局部螺旋,H-DNA,DNA的三级结构,双链DNA多数为线形分子，但有些为双链环状DNA（dcDNA） 超螺旋 松弛环形DNA 解链环形DNA 负超螺旋 生物体内绝大多数螺旋DNA以负超螺旋形式存在；真核细胞染色质和一些病毒的DNA是双螺旋线形分子，双螺旋DNA盘绕组
8、蛋白形成核小体。,DNA的三级结构,DNA双螺旋进一步扭曲即成 三级结构。 天然DNA有双链DNA（dsDNA）， 有的病毒为单链DNA（ssDNA） 在dsDNA中： 线形分子（大多数） 环状分子（dcDNA）：质粒、线粒体、叶绿体、病毒、细菌,超螺旋结构,特点： 可将长链压缩 在一较小体内； 密度大； 凝胶电泳中移 动速度快。,核小体中的 扭曲方式,在真核细胞染色质中， DNA双螺旋分子盘绕 在组蛋白上形成核小体. 许多核小体由DNA 连成念珠状结构，再盘 绕压缩成高层次的结构 染色体。,RNA的结构,大多数天然的RNA分子是以一条单链形式存在的，但在生理条件下，RNA分子也可以形成双螺旋
9、区，发卡式结构，茎-环结构等二级结构。这样的结构一般都出现在tRNA和rRNA分子中，RNA的双螺旋区的结构类似于A-DNA的结构。,RNA的功能,rRNA：核糖体的组成成分，细胞内最丰富的一类RNA，（80）； mRNA：最不稳定的一类RNA ，载有来自DNA的信息，在核糖体中，作为模板指导蛋白质的合成（3）； tRNA：在蛋白质生物合成的过程中，转运氨基酸到核糖体-mRNA复合物的相应位置（15%）。,tRNA（三叶草二级结构）,tRNA（三叶草二级结构）,1. 四环四臂 2. 氨基酸臂，3端有CCA-OH结构，其羟基可与携带的氨基酸形成共价键 3. D环和D臂 4. 反密码子臂和反密码子
10、环，3436位为与mRNA作用的反密码子 5. 可变环 6. TC臂 7. 含修饰碱基，不变核苷酸,酵母苯并氨酸tRNA的三级结构,rRNA,70S,80S,16S和5SrRNA的结构,rRNA,1)占RNA总量的80%，是构成核糖体的骨架。 2)核糖体功能： pro合成的部位. 3）结构：分大、小亚基 一、二级结构多已确定，但功能不清。,原核细胞：70S核糖体； 真核细胞：80S核糖体；,核酸的性质,大多数DNA为线性分子，分子极不对称，粘度极高，而RNA的粘度较小； 1. 核酸的水解 2. 核酸的酸碱性质 既有磷酸基，又有碱性基团，为两性电解质，通常表现为酸性； 3. 核酸结构的稳定性 4
11、. 核酸的紫外吸收 5. 核酸的变性、复性及杂交,核酸的水解,糖苷键和磷酸二酯键 1. 酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被酸水解；嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键稳定性差； 2. 碱水解：RNA的磷酸二酯键易水解，DNA的较稳定（见图）； 3. 酶水解：,核酸酶,1、核酸酶的分类,（1）根据对底物的 专一性分为,（2）根据切割位点分为,2、核酸酶的作用特点,外切核酸酶对核酸的水解位点,5,OH,B,3,B,B,B,B,B,B,B,蛇毒磷酸二酯酶 （ 5端外切得5-核苷酸）,牛脾磷酸二酯酶（ 3端外切3-核苷酸）,内切核酸酶对RNA的水解位点示意图,RNAase I,RNAase I,RNAase T
12、1,RNAase T1,Pu ：嘌呤 Py：嘧啶,RNAase T2,内切脱氧核酸酶对DNA的水解位点示意图,DNAase ,DNAase ,DNAase ,DNAase ,Pu ：嘌呤 Py：嘧啶,限制性内切酶, 类型 命名 意义,原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶。,常用的DNA限制性内切酶的专一性,酶,辨认的序列和切口,说明, A G C T T C G A , G G A T C C C C T A G G , A G A T C T T
13、 C T A G A , G A A T T C C T T A A G , A A G C T T T T C G A A , G T C G A C C A G C T G , C C C G G G G G G C C C ,Bam H I,Alu I,Bgl I,Eco R I,Hind ,Sal I,Sma I,四核苷酸，平端切口,六核苷酸，平端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,六核苷酸，粘端切口,核酸的酸碱性质,碱基、核苷、核苷酸 核苷酸含有磷酸和碱基，为两性电介质，在一定条件下形成兼性离子,核酸的紫外吸收,核酸中嘌呤和嘧啶环的共
14、轭体系强烈吸收240290nm波段紫外光，其最高的吸收峰接近260nm； RNA的紫外吸收光谱比DNA(相同核苷酸数目)的高； 核酸的光吸收值比其各核苷酸成分的光吸收值之和少3040%； 增色效应 & 减色效应,核酸的紫外吸收,核酸的紫外吸收,应用： 1、不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行定性、定量测定。 1 OD相当于：50g/ml DNA 40g/ml RNA 2、确定所提取的核酸是否纯品。 1）DNA： 1.8 纯品 OD260/OD280 1.8 RNA 污染 1.8 pro 污染 2）RNA： OD260/OD280 2.0 纯品,核酸结构的稳定性,1. 碱基对间的氢键
15、 氢键较弱，但氢键的集合能量很大 如不能使氢键全部打开，则打开的氢键有恢复原有状态的趋势 RNA中单链突环互相靠近形成的环间碱基对是三级结构稳定的重要因素 2. 碱基堆积：对维持核酸空间结构有重要作用 3. 环境中的正离子,核酸的变性、复性及杂交,1. 变性（氢键断裂，不涉及共价键的断裂）核酸降解 增色效应 DNA的变性为爆发式； 因素：温度、酸碱、变性剂等； 2. 复性： 3. 分子杂交：,热变性与Tm,Tm：加热变性使DNA螺旋结构失去一半时的温度为（8295） 影响因素 DNA的均一性 G-C对含量：（G+C）%=（Tm-69.3） 2.44 溶液的离子强度 pH 变性剂,核酸的复性,复性：“退火” 影响因素 单链片段浓度高，则复性速度较快 较大的单链片段扩散困难，错配频率高，复性较慢 片段内重复序列多，较易形成互补区，复性较快 维持一定的离子强度，消除磷酸基负电荷造成的压力，可加快复性速度 Cot1/2：复性反应的速度,分子杂交,分子杂交： 原位杂交 点杂交 狭缝印迹杂交 Southern杂交、Northern杂交,核酸的研究方法,1. 分离提纯 2. 超速离心 3. 凝胶电泳 4. 核苷酸的序列测定 5. PCR（聚合酶链反应体外扩增DN
