《色谱分离技术》ppt课件

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1、第7章 色谱分离技术,7.1 基本原理 7.2 分配色谱 7.3 凝胶过滤 7.4 离子交换 7.5 亲和色谱,7.1 基本原理,7.1.1 概述,1903年 俄国植物学家茨维持(，Tswet) 在填充碳酸钙柱中用以石油醚冲洗植物色素萃取物，得到各色区带; 1931年 氧化铝柱中胡萝卜素两种同分异构体的分离，表现出极高的分辨率; 1944年 出现纸层析; 1950年代 气相色谱出现，色谱分离的仪器化 1960年代 高效液相色谱的发展，高效固定相填料获得突破进展,随着生物技术的发展，色谱分离已成为生物产品高度纯化最有效的的方法之一。从多数生物产品纯化工艺来讲，色谱分离是产品包装前的最后纯化工序。

2、,色谱分离基本特点,(1)分离效率高 是所有分离纯化技术中最高的(不计电泳)。若用理论塔板数来表示柱效率，每米柱长可达103105块塔板。 通常色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。 (2)应用范围广 从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳定的化合物，都可用色谱法分离。,(3)选择性强 色谱分离有很强的选择性, 可通过多种途径选择不同的操作参数，以适应各种不同样品的分离要求。,(4)高灵敏度的在线检测 (5)快速分离 高效细颗粒固定相载体和高压液相色谱分离技术的采用，保证在高分离效率前提下的高分离速率，可以提高单位时间的产量。 (6)过程自动

3、化操作,色谱/层析/色层机理：利用多组分混合物中各组分物理、化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理、化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离、纯化。,吸附色谱是指混合物随流动相通过固定相吸附剂时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离。,7.1.2 色谱（Chromatography)分离的分类,7.1.2.1 按分离机理不同分类,(一)吸附色谱分离(Adsorption Chromatography，AC),吸附色谱是各种色谱分离技术中应用最早的一类，传统吸附色谱以各种无机材料为吸附剂。新型吸附色谱技术，如疏水作用

4、色谱、金属整合作用色谱和共价作用色谱等。,分配色谱流动相和固定相都是液体，利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。 操作方法有两种：一种是固定相是将与流动相互不相溶的液体涂渍到载体上形成的；另一种是逆流分配法， 固定相(重相)和流动相(轻相)都放在一组特别的分配管中，用来完成这种操作的仪器称为逆流分配仪。,(二)分配色谱(Distribution Chromatography，DC),离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的结合力而将其分离。 该法适合于离子和在溶剂中发生电离物质的分离。 离子交换

5、色谱广泛用于生物大分子分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化。,(三)离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography，IEC),(四)凝胶色谱(Gel Chromatography，GC),凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术。凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。 凝胶是不带电荷的多孔网状结构的物质，每个凝胶颗粒的细微结构就如一个筛子。混合物随流动相流经凝胶柱时，较大分子不能进入所有的凝胶网孔而受到排阻，与流动相一起首先流出；小分子能进入凝胶网孔，凝胶柱中流出次序靠后。,生物体内许多大分子化合物具有与其结构相

6、对应的专一分子可逆结合的特性(亲和力)。 把与目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，则当含有目的产物的混合物(流动相)流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。,(五)亲和色谱(Affinity Chromatography，AFC),广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。,7.1.2.2 按固定相形状不同分类,(1)柱色谱,(2)纸上色谱,进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品的制备和工业生物产品的分离与纯化。,(3)薄层色谱,主要用于分析，也可用于小量样品的制备。,7.1.2.3 其他分类方法,(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超

7、临界色谱,(2)根据操作压力分类 低压色谱(0.5MPa)、中压色谱(0.55MPa)和高压色谱(550MPa)。,(3)根据洗脱操作分类,根据洗脱时展开方式的不同，可分为洗脱展开法、前沿分析法和置换展开法3种。,色谱和电泳是目前最好的两种分离方法，其塔板数可达百万数量级。但电泳法目前尚不能用于生产规模的分离与纯化，因而色谱技术成为分离和纯化蛋白质、酶、核酸、多糖等生物大分子物质的核心手段。,根据一次进样量的多少，色谱分离规模可分为： 分析色谱：10mg 半制备色谱：1050mg 制备色谱：0.110g 工业色谱：20gd,7.1.3 生物工业中的色谱分离,(1) 色谱分离的规模,(2) 色谱

8、分离方法的选择,对于蛋白质、酶、核酸等生物大分子，由于它们分子量大、易失活以及具有生物专一亲和性等特点，较多地选用多糖基质(如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等)离子交换色谱、疏水作用色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。 对于生物小分子的代谢物，由于它们分子量小、结构和性质比较稳定、操作条件不太苛刻，采用吸附、分配和离子交换色谱进行分离较为适宜。其中，氨基酸、有机酸、核苷酸等一些离子型化合物的生产多用离子交换色谱分离；而抗生素、生物碱、萜类、色素等次级代谢产物多采用吸附色谱或反相分配色谱分离。,色谱分离原理示意图,7.1.4 色谱分离的基本原理,色谱操作中，加入洗脱剂而使各组分分层的操作称为展开(Develop

9、ment)，洗脱时从柱中流出的溶液称为洗脱液(Eluate)，而展开后各组分的分布情况称为色谱(Chromatography)。,组分对固定相的亲和力：。 随着洗脱剂加入，两组分将逐渐分开，亲和力弱的“”分子移动快，先从色谱中分离出来，亲和力强的“”分子后从色谱柱中出来。,被分离的混合物在流动相携带下通过固定相时，溶质在固定相和流动相之间的平衡关系服从分配定律：,7.1.4.1 分配色谱,分配色谱利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同而分离，相当于连续性的溶剂萃取。,(7-01),cs、c m分别为溶质在固定相和流动相中的浓度，Kd为分配系数。,离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸

10、附色谱，前者主要是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。,7.1.4.2 吸附色谱,吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的。,在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附方程式来表示：,(7-14),(7-15),A吸附剂，B游离在液相中的溶质，AB表示吸附剂与溶质的结合方式。 Ka、Kd分别为吸附与洗脱常数。,对大多数化合物而言，Langmuir吸附等温曲线是应用最多的:,双曲线(凸形线),凝胶色谱分离原理示意图,小分子溶质可自由进入凝胶颗粒内部，下移通道较大， 下移速率较慢。,7.1.4.3 凝胶色谱,凝胶色谱分离已成为一种通用的分离方

11、法，在生物大分子物质的制备与生产技术中被广泛应用。,(7-28),(7-29),(7-30),凝胶色谱柱的总体积Vt分为3部分：,Vo为凝胶颗粒之间空隙的总体积；Vi为凝胶颗粒内部空隙总体积；Vm为凝胶颗粒基质本身所占体积。 溶质分子充满色谱柱的体积，也即洗脱容积为：,或,Kd1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0Kd1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。,工业规模色谱大多采用柱色谱法。,7.1

12、.5 柱色谱分离法,7.1.5.1 柱色谱吸附剂,色谱所用吸附剂对分离性能密切相关。用于生物产品分离的色谱柱应尽可能满足下述要求： (1)分离能力强： (2)分离速度高； (3)处理能力大； (4)目的产物回收率高，生物活性损失小； (5)使用寿命长，可再生，要求可反复再生使用半年以上； (6)成本较低，价格合理。,(一)无机基质吸附剂,用作分离介质的硅胶是人工合成的多孔二氧化硅，其表面含有很多硅羟基团，可以进行表面化学修饰(化学键合)或改性。以自由硅羟基对各种键合反应最为重要。,1硅胶(Silica Gel),活性炭是憎水性吸附剂，适宜于从水溶液中吸附非极性物质。 活性炭柱色谱分离样品上柱量

13、大，分离效果好，来源较易，价格便宜，适用于大量制备性的分离。但活性炭生产原料不同，制备方法及规格不一，其吸附力不像氧化铝、硅胶那样容易控制，因此应用不广。,2活性炭,羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2， 与生物体有很好的相容性。,3羟基磷灰石,(二)有机基质吸附剂,琼脂糖是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合而成的链状多糖，是生物大分子物质色谱分离操作最常用的基质之一。 用环氧氯丙烷使琼脂糖交联，可增强基质稳定性，调节交联剂和琼脂糖的比例可控制凝胶珠体的孔度大小。 琼脂糖颗粒中带有大量的OH基团， 亲水性好， 且可以方便地进行化学修饰，接上一些官能团，以便与某些接枝“手臂”或配基

14、共价结合，适应于各种色谱分离技术。,1琼脂糖(Agarose),2葡聚糖(Dextran),葡聚糖(Dextran)是-1，6键相连的葡萄糖聚合物。由环氧氯丙交联葡聚糖得到的珠粒，商品名称为Sephadex。 由于多糖骨架上有大量羟基，使得它的亲水性比Sepharose还强。凝胶的化学稳定性和热稳定性也很好。 可以高压消毒，并且性质不变。,纤维素是-1，4键相连的D-葡萄糖(偶而有1，6键合)的线性聚合物，具有很高的孔度和亲水性。机械强度比葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶都好。它同样可以进行化学修饰，以满足不同的需要。 纤维素及其众多的衍生物已被广泛地用于蛋白质类物质的纯化。,3纤维素,聚丙烯酰胺凝胶是

15、由丙烯酰胺与交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺共聚得到的。聚丙烯酰胺亲水性好，pH 110范围内稳定，不为生物降解，在色谱分离中有广泛用途。它主要用于凝胶过滤法和凝胶电泳法的生物大分子的分离中。,4. 聚丙烯酰胺凝胶,聚乙烯醇系Toyo Pearl是以交联聚乙烯醇为骨架的凝胶过滤介质。 Toyo Pearl为多孔的三向网状结构，大分子链上含有丰富的羟基，骨架为高亲水性。除广泛用于凝胶过滤外，还可进行化学改性而得到含有多种官团的离子交换吸附剂及亲和吸附吸附剂。,5聚乙烯醇,柱色谱装置一般由进样、流动相供给、色谱柱、检测及流分收集器等部分构成，其中色谱柱是色谱分离装置的关键部件。,柱色谱分离法装置,7.1

16、.5.2 柱色谱装置,(一)进样及流动相供给装置,(二)色谱柱,柱的分离效率与柱长成正比，与柱径成反比。色谱柱细长，一般ld2030。柱直径多为215cm。 柱径增加可使样品负载量成平方地增加，但柱径大时，流动很难均匀，色带不易规则，分离效果差；柱径太小时，进样量少，且使用不便，装柱困难。,蛋白质中的肽键和芳香族氨基酸分别在206215nm以及280nm处有很强的光吸收，生物大分子物质色谱分离中，常用紫外分光光度计作为检测器，直接了解蛋白质的分离情况。 流分收集器是将底部流出的液体，每次按一定量分别收集的仪器。以容量式和质量式较为方便实用。,(三)检测器与流分收集器,溶剂性质须适应所用固定相，大量样品溶液导入色谱柱后不马上扩散，集中在柱头，不会在柱内展开。,(一)样品溶解与进样方法,7.1.5.3 柱色谱操作技术,样品上柱后，加入洗脱剂，使样品分离并收集目的产物。展开操作有多种方式，实际使用中选择何种操作方式取决于样品性质、所需产品纯度及产率等。,(