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1、临床医学论文-解脲脲原体及其生物群与泌尿生殖道疾病间的关系作者：吴鹏 孙竞 朱名安， 李蓓 摘 要 目的：探究解脲脲原体及其不同的生物群与各类泌尿生殖道疾病间的关系。方法：通过液体培养法对 260 份泌尿生殖道标本中解脲脲原体感染的情况进行检测，并针对其多条带蛋白基因设计引物，通过聚合酶链反应将检测到的解脲脲原体进行分群。结果：宫颈炎和习惯性流产、早产患者中解脲脲原体的分离阳性率明显高于正常对照组（P0.05）。通过分群研究发现，在正常人和不孕症患者中主要以生物群 1 型感染为主，而宫颈炎患者与习惯性流产、早产患者中分离株主要为生物群 2 型。结论：解脲脲原体是宫颈炎和习惯性流产、早产的重要致
2、病因素，其生物群 2型与这两类疾病的发生密切相关。关键词 解脲脲原体；泌尿生殖道；生物群Abstract: Objective To study the relationship of genitourinary tract diseases with ureaplasma urealyticum and its biovars. Methods The distribution of U. urealyticum in 260 secretions samples of genitourinary tract through the culture in selective medium w
3、as analyzed and the isolated strains was categorized into two biovars by polymerase chain reaction (PCR) assay targeting the gene of the multi-band protein. Results The isolation rates of U. urealyticum in the patients with gential tract inflammation and habitual abortion were significantly higher t
4、han that in the healthy subjects (P0.05). According to the results of PCR, biovar 1 were the main biovar in the common control and infertility group and the patients of gential tract inflammation and habitual abortion were mainly infected with biovar 2. Conclusion U. urealyticum is an important fact
5、or in the formation of gential tract inflammation and habitual abortion, and there is a distinct correlation between biovar 2 and these two kinds of diseases. Key words: Ureaplasma urealyticum； Genitourinary tract； Biovar 解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，Uu）是成人尤其是性成熟妇女泌尿生殖道常见的正常微生物之一，也是泌尿生殖道感染的重要病因。从表型和
6、基因型上可将解脲脲原体分为 2 个生物群：微小脲原体（Ureaplasma Parvum，即传统意义上的解脲脲原体生物群 1，包括血清型 1，3，6，14）和解脲脲原体（Ureaplasma Urealyticum, 解脲脲原体生物群 2，包括另外 10 个血清型）。不论是生物群 1 还是 2 均能寄居在人泌尿生殖道, 并且不同的生物群和血清型可能与不孕症、自然流产、死胎、女性生殖道炎症等威胁女性健康的疾病有着密切关系1-2。为了使临床医生能够更准确地对检测结果做出判断，区别正常携带与疾病感染状态，以便及时、有效地治疗，本文通过液体培养法对 158 份临床分离和 102 份正常无症状者的泌尿生
7、殖道标本中感染解脲脲原体的情况进行检测，并根据不同生物群间多条带蛋白基因的差别进行分群3-4，从而探究解脲脲原体及其不同生物群与宫颈炎和习惯性流产、早产等疾病间的关系。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本来源: 2004 年 1 月至 2005 年 11 月郧阳医学院附属太和医院妇产科、皮肤科送检的泌尿生殖道标本共 158 份，其中不孕症患者 28 人，习惯性流产、早产患者 38 人，宫颈炎患者 92 人。同时随机选择 102 名正常无症状体检者作为正常对照组。1.1.2 试剂和仪器: Uu 液体培养基采用法国梅里埃公司生产的支原体选择性液体培养基试剂盒，PCR 扩增仪（PE2400 型
8、）为美国 PE 公司产品，Taq DNA 聚合酶、DNA 标准分子量 marker 购自华美公司。1.1.3 引物设计与合成: 从 GeneBank 中查到解脲脲原体多条带抗原（MBA）的基因全序列，参照 Knox 等3-4文献利用 Array designer 软件设计一对分群引物并送上海生物工程公司合成：MBA-F,5-GTATTTGCAATCTTTTATATGTTTTTCG-3；MBA-R,5-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAATTTC-3 1.2 方法1.2.1 标本培养: 以无菌方法将待检样品直接接种于支原体选择性液体培养基，37 培养 2436 h 后观察结果，培养
9、基由桔黄色变为红色诊断为 Uu 培养阳性。48 h 后仍无颜色改变者为阴性。1.2.2 菌株分群: 直接取液体培养阳性的样本 200 l 到 1.5 ml 的 EP 管中，10 000 转/min 离心 3 min，弃上清。沉淀用 PBS 洗涤两次后加 500 l 的无菌去离子水悬起, 100 处理 10 min 后离心取 1 l 作为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应体系： 2.5 l 10buffer，0.25 l Taq 酶（5 U/l），1 l dNTP（2 mmol/L），2 l 引物（10 pmol/l），1 l 模板，加无菌去离子水至 25 l。PCR 反应条件：94 预变性
10、5 min，94 40 s, 60 40 s,72 40 s,共 30 个循环，最后 72 延伸 7 min。扩增产物的检测：取扩增产物 10 l 于 2.0%琼脂糖（内含 0.5 g/L 溴乙锭）TBE 缓冲系统进行电泳，紫外光下检测。2 结果2.1 不同人群泌尿生殖道样本 Uu 培养结果（见表 1）表 1 不同人群泌尿生殖道样本 Uu 培养结果（略）注：与正常对照组比较*P0.05 数据显示：不孕症患者、习惯性流产和早产患者与宫颈炎患者中 Uu 分离阳性率均明显高于正常对照组(25%)。但 2 检验发现，习惯性流产、早产患者和宫颈炎患者与正常人间的差异具有显着性意义（P0.05）。2.2
11、Uu 生物分群与疾病间的关系通过表型和基因型可以将解脲脲原体分为 2 个生物群，以前的研究认为不同的生物群与细菌的致病性间具有相关性5-6。通过对解脲脲原体多条带抗原基因 PCR 扩增产物进行电泳分型，将在 403 bp 或 404 bp 处出现条带的样本归为生物群 1 型(Up)，扩增产物长度为 448 bp的样本归为生物群 2 型(Uu)。不同泌尿生殖道疾病患者中分离出的解脲脲原体的分群结果见表 2。表 2 不同人群的 Uu 生物群分类（略）结果显示，在习惯性流产和宫颈炎患者中生物群 2 型的检出率明显高于对照组(P0.05)。3 讨论Uu 是人类泌尿生殖道常见的共生微生物,Uu 在泌尿生
12、殖道寄居与感染的关系是当前一个比较令人们关注的课题。由于 Uu 两个生物群在生物学特性上存在许多差异,临床检查到 Uu, 并不能确定是携带状态还是感染状态,这给诊断与治疗带来一定的困难。因此近年来有人试图从 Uu 的两群临床流行病学特征上寻找Uu 寄居与感染之间关系。PCR 具有敏感性高、特异性强、操作简便等特点,广泛用于微生物的检测。已有的研究显示靶序列如 16 SrRNA 基因、脲酶基因亚单位、MBA 基因 5端采用 PCR 法可以鉴别 Uu 的这两个生物群7-8。本文采用 PCR 法进行 Uu 生物群和血清型的检测,结果显示 MBA 基因对检测 Uu 的血清型具有潜在价值。我们设计合成了
13、检测 Uu MBA5端靶序列,对 Uu14 个血清型检测时发现第 1 群扩增片段长度为 403 bp 或 404 bp,第 2 群为 448 bp,因此可以通过电泳对两个生物群 Uu 进行鉴别。通过支原体选择性培养基对临床泌尿生殖道分泌物标本进行检测是多年来认为检测解脲脲原体的金标准，但它不能对解脲脲原体的不同生物群进行分析。利用 MBA（Multiple Band Antigen）基因间的微小差别设计引物进行 Uu 生物分群的 PCR 方法经多年的应用，敏感性好，特异性高，能用于对液体培养基培养阳性的标本进行确认及生物分群。孔繁荣等9研究显示，在正常无症状人群中，25%携带有解脲脲原体，其中
14、 78%属于生物群 1 型，说明生物群 1 型可能主要以寄居状态存在于泌尿生殖道。我们检测的 260 份标本中，有 35%检测到解脲脲原体的存在。在习惯性流产、早产和宫颈炎患者中解脲脲原体的分离阳性率明显高于正常人，表明 Uu 可能是习惯性流产、早产和宫颈炎的重要致病因子。从分类上来看，习惯性流产、早产和宫颈炎患者中分离出的解脲脲原体生物群 2 型的比例明显提高，提示生物 2 群的感染可能与这两类疾病相关。因此，如果从患者泌尿生殖道样本中分离出解脲脲原体生物群 2 型，应该及时治疗以阻止其继续侵袭,以免导致更为严重的后果。本研究中不孕症患者解脲脲原体的分离阳性率及其生物分群与正常对照间的差异无
15、显着性，与范宝剑等10的研究报道不一致，这可能与我们的样本量太少和不同地区惟患因子差异等因素有关。参 考 文 献1 Potts JM,Ward AM,Rackley RR. Association of chronic urinary symptoms in women and ureaplasma urealyticumJ. Urology,2000,55(4):486-489. 2 Hudson MM, Talbot MD. Ureaplasma urealyticumJ. Int J STD AIDS,1997,8 (9):546-551. 3 Kong F, Zhu X,Wang W,
16、 et.al. Comparative analysis and serovar-specific identification of multiple-banded antigen genes of Ureaplasma urealyticum biovar 1J. J Clin Microbiol,1999,37(3): 538-543. 4 Knux CL, Giffanl P, Timms P. The phylageny of Ureaplasma urealyticum based on the mba gene fragment J. Int J Syst Bacterial, 1998 ,48(R4) :1323 一 1331. 5 覃春容，张帝开.解脲脲原体的生物群、血清型与致病J. 中国
