重组质粒的构建 转化 筛选和鉴定

《重组质粒的构建 转化 筛选和鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组质粒的构建 转化 筛选和鉴定（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、 山东大学实验报告 2012 年 11 月 26 日姓名 系年级 学号 科目 分子生物学实验 题目 重组质粒的构建 转化 筛选和鉴定 组别 周一 第 1 页 共 6 页 分子生物学实验报告一、 实验目的1学习在实现 DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的 DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。2.学习设计构建重组 DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的 DNA 酶切的操作。3.学习利用 T4DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的 DNA 片段连接起来，构建体外DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。4.掌握利用 Cacl

2、2 感受态细胞的方法。5.学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法。6.掌握 互补筛选法和 PCR 检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的 DNA 片段的大小。二、 实验原理外源 DNA 与载体分子的连接即为 DNA 重组技术，这样重新组合的 DNA 分子叫做重组子。重组的 DNA 分子式在 DNA 连接酶的作用下，有 Mg2+、ATP 存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源 DNA 分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过 互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子的鉴定。1.重组子的构建酶切时首先要了解

3、目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体 DNA 时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的 DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的 DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或目的 DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较

4、复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成，在双酶切体系中，限制性内切酶在使用时应遵循“先低盐后高盐，先低温后高温”的原则进行反应。（要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的 DNA 数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的 DNA 的量，以及相应的所需酶的量。可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的 10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在 50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过 5%，就会抑制酶的活性。 ）连接反应总是紧跟酶切反应，外源 DNA 片段与载体分子连接的方法即 DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核算内切

5、酶和 DNA 连接酶催化完成的。DNA 连接酶催化两双链 DNA 片段相邻的 5-磷酸和 3-OH 间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的 DNA 连接酶是来自 T4 噬菌体的 T4 DNA 连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体 DNA 和外源 DNA 的摩尔数之比控制在 1:（13）之间，可以有效地解决 DNA 多拷贝插入的现象。反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是 16，用常用的连接时间为 12-16h。2.感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组 DNA 转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源 DN

6、A 片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细 山东大学实验报告 2012 年 11 月 26 日姓名 系年级 学号 科目 分子生物学实验 题目 重组质粒的构建 转化 筛选和鉴定 组别 周一 第 2 页 共 6 页 分子生物学实验报告胞具有摄取 DNA 的能力，或人为地将 DNA 导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒 DNA 的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。目前常用的感受态细胞制备方法有 CaC

7、l2 法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为 15%的无菌甘油，-70可保存半年至一年。经过 CaCl2 处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA 分子进入。在低温下，将携带有外源 DNA 片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源 DNA 分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以 E.coli DH 5 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19 质粒在 42下热击 90s，实现转化。3.重组子的筛选鉴定重组 DNA 转化宿主细胞后，并

8、非所有的受体细胞都能被导入重组 DNA 分子，一般仅有少数重组 DNA 分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组 DNA 分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组 DNA 分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源 DNA 片段形成非期待重组 DNA 分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及 PCR 检测方法。抗药性筛选主要用于重组质粒 DNA 分子的转化子的筛

9、选，而不含重组质粒 DNA 分子的受体菌则不能存活， 互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒 PUC19 携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PUC19 的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒 PUC19 进入 E.coli DH 5 后，通过 -互补作用，形成完整的 -半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用 -半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH 降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的 E.coli DH 5，没有 -半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有

10、机碳源，不使培养基 pH 降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体 DNA 因为目的基因的插入位点在 PUC19 乳糖利用基因内部，不能形成 -互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体 DNA 菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒 DNA 分子的大小，可将重组的载体 DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。三、 实验仪器和材料试剂菌株：E.coli

11、DH 5培养基： LB 培养基、麦康凯培养基（加入 AP）仪器：高速离心机，恒温震荡培养箱，恒温水浴锅，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf 管，微量移液器，计时器试剂：TAE 电泳缓冲液(10)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)， DNAHind Marker，DL 2000plus DNA PUC19 质粒，酶切 10buffer，Hind ,重蒸水 山东大学实验报告 2012 年 11 月 26 日姓名 系年级 学号 科目 分子生物学实验 题目 重组质粒的构建 转化 筛选和鉴定 组别 周一 第 3 页 共 6 页 分子生物学实验报告四、 实验

12、步骤1. 载体与外源片段的酶切pUC19（自提） DNA(comm) pUC19(comm)ddH2o 13.5-12.5 66.0 37.510x/buffer 2.0 10.0 5.0DNA 3.0-4.0 15.0 5.0HindIII 1.5 9.0 2.5Total 20.0 100 50.0混合均匀，上下摇晃 4000 转 1min均分为两管，37水浴 2hrs1h 后，取一管，1%琼脂糖 凝胶电泳，100v 电压 40min2. 载体与外源片段的链接Comp Vol (l)1 ddH2O 3.22 10xT4 连接酶 Buffer 1.03 pUc19/III 1.5-2.04

13、/III 3.5-3.05 T4 DNA 连接酶 0.8Total10.0混合均匀，上下摇晃 4000 转 1min16保存3. 感受态细胞的制备与转化E.coli DH5 感受态细胞的制备甘油管LB 平板（活化）单菌落LB 平板（37 o/n）20mlLB(37o/n) 1%转接至新鲜 LB 液372-2.5hrs冰浴 10min1.5mlx2，4000rpm/6000rpm 5minVotex+800ml CaCl2吹吸悬浮细胞4000rpm 5min 吸弃上清100l 0.1M CaCl2，轻悬，冰浴 20min感受态细胞4. 质粒的转化及重组质粒的筛选分组 步骤 c.c DNA 冰浴

14、热激 冰浴 复苏 培养基涂布平板ligation麦+AP 50lx1I-test 100 5.0 5min 42 5min LB 100lx2-10min 90s 900 150lx2l/tube 200lx 2 山东大学实验报告 2012 年 11 月 26 日姓名 系年级 学号 科目 分子生物学实验 题目 重组质粒的构建 转化 筛选和鉴定 组别 周一 第 4 页 共 6 页 分子生物学实验报告II-tranfControl50 pUc190.5 37 1h麦+AP 50lx1III-c.c 50 麦+AP 50lx1Control 麦 50lx1预留一个麦+AP 平板静置 10min，于 37倒置培养 16-20hrs5. 重组质粒的提取及电泳检测鉴定I 中的平板白色单菌落（无菌牙签）接入预留麦+AP 平板4-6 个菌落/组37倒置 o/n五、 实验结果pUC19 和 DNA 经 Hind III 单酶切作用结果的电泳检测电泳结果表明：DNA 分子量 2 万 3bppUC19 商业和测试酶切完全，分子量在 2300+，经查的 2686bp19