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1、临床医学论文-角膜移植免疫耐受的研究进展【摘要】 排斥反应是角膜移植失败的主要原因。临床治疗中常用的非特异性免疫抑制剂，如糖皮质激素、环孢素 A 等，存在着许多全身副作用。因此诱导受体建立针对供体角膜的特异性免疫耐受是治疗排斥反应的理想方法。免疫耐受的机制主要包括 T 细胞克隆失活（anergy）、克隆清除(delete)、细胞因子介导的抑制及免疫平衡等。现就目前人工诱导免疫耐受的方法作一综述。 【关键词】 角膜移植免疫耐受Advancement of corneal transplantation immune toleranceAbstractCorneal transplantation
2、 is one of the most successful forms of organ transplantation in humans. However, immunologic rejection continues to be a common cause of graft failure. To obtain the long term survival of corneal grafts, especially in high risk recipients, systemic immunosuppression such as cyclosporine A and dexam
3、ethasone are usually used in clinic. But these drugs have many undesirable side effects. So, it is necessary to search novel immunosuppression to induce antigen-specific tolerance. The immune tolerance mechanism includes the induction of specific T cell anergy, delete or immunoregulation. KEYWORDS:
4、corneal transplantation; immune tolerance0 引言排斥反应是角膜移植失败的主要原因1,2。现临床中常用的治疗药物如糖皮质激素、环孢素 A 等均为非特异性免疫抑制剂，同时抑制 CD4+T 和 CD8+T 细胞，长期使用增加癌和感染的发生率。因此诱导受体产生针对供体角膜的特异性免疫耐受是解决排斥反应、短期用药即可使移植物长期存活的理想方法。免疫耐受的机制主要为 T 细胞克隆失活（anergy）、克隆清除(delete)、细胞因子介导的抑制及免疫平衡等。现就目前人工诱导免疫耐受的方法作一综述。1 阻断共刺激通路诱导免疫耐受 角膜移植排斥反应主要是由 T 淋巴细
5、胞介导的迟发型超敏反应， CD4+T 细胞是主要的效应细胞，其激活需要两种信号刺激，第一信号为特异性抗原识别信号，即 CD4+T 细胞表面的 TCR-CD3 复合体与抗原递呈细胞（APC）的抗原多肽-MHC类分子复合体结合，第二信号为共刺激信号，即 APC 表面黏附分子与CD4+细胞表面相应配体结合。如只有第一信号，缺乏共刺激信号的协同作用，接受抗原刺激的 CD4+细胞不能有效活化，而处于特异性无反应状态（克隆失活），表现为免疫耐受。目前认为最重要的共刺激途径是 B7-CD28/CTLA-4 和CD40-CD154。1.1 B7-CD28/CTLA-4 共刺激途径 CD28 与 CTLA-4
6、是一对正负调节性共刺激分子，各表达于 100%的活化 CD4+细胞表面及活化 24h 后的 CD4+细胞表面，竞争与 APC 表面的 B7（CD80,CD86）分子结合。CD28 与 B7 结合可导致 CD4+细胞扩增、IL-2 分泌、细胞周期蛋白表达上升、CD154 表达上调；而 CTLA-4与 B7 结合减少 IL-2R 表达及 IL-2 分泌，将细胞阻滞于 G1 期抑制其激活3。这一正负调节途径对于免疫动态平衡很重要。利用 CTLA-4-B7 负性共刺激信号及其竞争性阻断 CD28-B7 正性共刺激信号途径的作用，可诱导同种移植物的免疫耐受。CTLA-4Ig 是由 CTLA-4 的细胞外
7、功能区与人 IgG1FC 段融合形成的可溶性重组融合蛋白,是 CTLA-4 的功能性替代物。Comer 等4在鼠角膜移植排斥模型中发现：无论是术前使用 CTLA-4Ig 浸泡供体还是术后使用 CTLA-4Ig 治疗受体，移植的角膜存活时间均明显延长。大量动物实验表明角膜移植术后，供受体接合区域有大量 CD80（B7-1）及 CD86（B7-2）的表达，联合应用抗 CD80 及抗 CD86 单克隆抗体，通过阻断 CD28 与 B7 结合可诱导免疫耐受，延长角膜同种异体移植物的存活时间5。1.2CD40-CD154 共刺激途径 特异性抗原识别信号可在 4h 后刺激 T 细胞表面表达 CD1546，
8、CD154 与静止的 APC 表面的 CD40 结合，提供直接共刺激信号活化 APC，诱导其表达 B7 分子，B7 再与 CD4+T 细胞表面的 CD28 结合，提供间接共刺激信号活化 CD4+T 细胞。此过程中，CD40/CD28 构成了正性信号循环7。因此阻断 CD40-CD154 共刺激途径，将减少 APC 表达 B7，使 T 细胞缺乏共刺激而进入克隆失活。Qian 等8,9在鼠角膜移植模型中发现：结膜下或腹腔内注射抗 CD154 单克隆抗体可预防无血管化的角膜发生移植排斥反应、延迟血管化的高危角膜出现排斥反应的时间、抑制 Th1 产生 IFN-。但研究中也发现,任何单抗的单独应用,均不
9、能获得长期稳定的免疫耐受，为解决这一问题，Safley 等10在将猪胰岛移植给鼠的实验中，使用 CTLA-4Ig和抗 CD154 单克隆抗体联合阻断 B7-CD28/CD40-CD154 共刺激途径，协同诱导免疫耐受，使移植物获得了长期存活。但这一结果在鼠角膜移植模型中并未得到支持，Ardjomand 等11发现无论是单独还是联合使用 CTLA-4Ig 和抗 CD154 单克隆抗体，角膜移植物的存活时间都无明显差别，而且对于 CD28 基因敲除的小鼠，术后加用抗 CD154 单克隆抗体治疗后，角膜移植物的存活时间也未见延长。因此 CD28 和 CD154 共刺激途径的关系及其联合被阻断时是否可
10、协同诱导免疫耐受需进一步探讨。目前，阻断一种或两种共刺激途径，同时联合应用单抗（如抗 CD25 单抗、抗 IL-2R 单抗、抗 LFA-1 单抗等）来诱导长期稳定的免疫耐受，已相继在鼠的皮肤及心脏移植实验中获得成功12,13，但在角膜移植中尚未见报道。ICOS-ICOSL 是 CD28-B7 家族的另一重要成员，在 T 细胞的活化中发挥重要作用，Guillonneau 等14在鼠心脏移植模型中发现，单独使用抗 ICOS 单克隆抗体或联合应用 CD40 抗原可延长移植物的存活时间并抑制晚期免疫排斥反应的发生、诱导长期免疫耐受，其机制可能是慢性排斥反应依赖 ICOS-ICOSL 而非 CD40-C
11、D40L 来实现的。现在还发现另一种重要的共刺激信号 CD134-CD134L，它在移植排斥反应中可协同 CD28-B7 调节 T 细胞功能，联合阻断时有助于诱导长期免疫耐受15，但其具体调节机制还不清楚，有待进一步研究。2 Fas/FasL 介导细胞凋亡诱导免疫耐受 角膜能成为免疫赦免器官，Fas/FasL 介导的细胞凋亡在其中发挥重要的作用。最初，我们多是在 CTL 细胞的非分泌型杀伤机制中认识到 Fas/FasL：FasL表达在细胞表面，Fas 表达在靶细胞表面，二者结合后诱导靶细胞分子胞内段启动致死信号，使靶细胞在基因控制下发生主动性程序性死亡（细胞凋亡）。但是在机体中，还有这样一部分
12、活化的 T 细胞，其表面表达 Fas，而角膜内皮和上皮细胞表面表达 FasL（眼前房内还可检测到 sFasL），使进入角膜内的活化的 T 细胞凋亡,而角膜细胞本身免于杀伤。在角膜移植术后，角膜内皮和上皮细胞表面的 FasL 表达无下调16、房水中 sFasL 的含量增加（尤其在角膜排斥反应来临之前增加更明显）17，这些均有助于角膜成为免疫豁免区。利用 Fas/FasL 介导细胞凋亡这一机制，可通过诱导移植物高表达 FasL 形成免疫耐受而延长移植物的存活期。动物实验已证实，通过腺病毒载体将 FasL cDNA 基因转导入鼠的肾脏、胰岛、角膜移植物中，使其表达 FasL，可保护移植物不被受体免疫
13、系统排斥，延长其存活时间。但研究中也发现,当 FasL 过度表达于供体角膜表面时，可导致供体角膜内大量多形核白细胞浸润，反而加速了移植的失败18,这可能还与表达 Fas 的角膜细胞自身相互作用并发生破坏有关。故对 Fas/FasL 通路调控凋亡的应用还需进一步研究。3 克隆清除或使 T 细胞衰竭诱导免疫耐受3.1 克隆清除 可分为中央型清除和周围型清除。角膜移植免疫耐受中很少使用中央型清除（胸腺清除），多为周围型清除，即在移植期间使用全 T 细胞免疫毒素或其它清除抗体（如抗 CD3、抗 CD4、抗 CD8 单克隆抗体）清除循环中的成熟 T 细胞，在移植物植入时淋巴细胞活化、增殖最强烈的时候阻止
14、免疫反应，使移植物和免疫系统在移植后更为静止的时期“相遇”，导致免疫应答的转化，结合其它克隆失活机制进入免疫耐受,Pindjakova 等19在鼠异种角膜移植模型中，使用抗 CD4 单抗处理受体，结果减少了细胞因子 IL-2，IL-4，IL-10 的产生，显着延长了移植物的存活。 3.2 诱导 T 细胞衰竭 过强的免疫应答可使特异识别该抗原的淋巴细胞库枯竭。超抗原即可引起这种现象，其在极低浓度即可比普通抗原高数十倍至数千倍的过度刺激 T 细胞，活化的 T 细胞大量被清除，导致 T 细胞功能和数量失调，继发免疫抑制状态。超抗原还能抑制 CD4+CD25+调节 T 细胞的活性、抑制效应T 细胞的增
15、殖，但具体机制不清20。接英等21在大鼠高危角膜移植模型中，术前给予受体大鼠腹腔内注射超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素 B 亚单位（SEB），结果角膜植片及外周免疫器官中的 CD4+和 CD8+T 细胞数目均明显减少、促进细胞增殖的 IL-2 因子减少而抑制性细胞因子 IL-10 增加，受体淋巴细胞免疫耐受形成，角膜植片存活时间明显延长。4 诱导受体产生免疫偏离CD4+细胞根据其分泌细胞因子的不同可分为 Th1 和 Th2 两类亚群。Th1细胞分泌 IL-2，TNF，IFN-，介导细胞免疫；Th2 细胞分泌 IL-4，5，6，10，13，辅助 B 细胞增殖及抗体生成。正常状态下,Th1 和 Th2
16、细胞功能处于动态平衡之中。在同种异体移植时,Th1 启动迟发型超敏反应,是角膜植片中主要的浸润细胞22；Th2 通过分泌的细胞因子抑制 Th1 活性,而促使免疫耐受的形成23。因此促进宿主 Th1 型应答向 Th2 型应答转换是诱导移植耐受的另一策略，有报道，APC 内的巯基氧化还原剂具有调节 Th1/Th2 平衡的作用，Yamada 等24向受体鼠腹腔内注射药物诱导巨噬细胞内产生谷胱甘肽，延长了角膜植片的存活时间，其可能机制为巨噬细胞内的谷胱甘肽抑制了 Th1 的免疫应答。Sonoda 等25先预先将供体鼠 C57BL/6 的角膜组织植入受体 BALB/c鼠的前房内，然后再行角膜移植手术，结果角膜植片的存活期延长，这是因为植入受体前房内的供体组织诱导了受体前房相关免疫偏离（ACAID）。诱导移植耐受还可以通过阻断 Th1 细胞分泌的细胞因子或增强 Th2 细胞分泌的细胞因子的效应来实现。IL-10 是巨噬细
