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1、医学论文-紫杉醇诱导人子宫内膜癌细胞增殖凋亡的实验研究作者：甘泉，辛晓燕，刘玉，王德堂，郭会玲【关键词】 紫杉醇；子宫内膜肿瘤；,子宫内膜癌细胞珠；,增殖；,凋亡；,caspaseExperimental study on human endometrial adenocarcinoma cell apoptosis induced by taxol【Abstract】 AIM： To investigate the inhibition of proliferation and induction of apoptosis in vitro cultured human endometria
2、l adenocarcinoma cell （HEC1B） by taxol. METHODS： Human endometrial adenocarcinoma HEC1B cells were cultured in vitro and treated with 2， 4， 8， 16， 20 nmolL taxol for 48 h. Cell apoptosis was observed by nuclear staining and fluorescence microscopy and intracellular calcium fluorescence pixel values
3、of live cells were detected by laser scanning confocal microscope. RESULTS: Through the blockage of caspase pathway with caspase3 inhibitor， taxol induced apoptosis was suppressed in endometrial carcinoma cells. CONCLUSION: Taxol inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human endometr
4、ial adenocarcinoma HEC1B cells.【Keywords】 taxol; endometrial neoplasms; HEC1B; proliferation; apoptosis; caspase3【摘要】 目的：探讨紫杉醇对体外培养的人子宫内膜癌细胞（HEC1B）凋亡的诱导作用. 方法：体外培养的 HEC1B 细胞，用终浓度 2， 4， 8，16，20 nmol/L 的紫杉醇作用 48 h 后，荧光染色检测细胞凋亡的发生情况、caspase3及其抑制剂紫杉醇在诱导细胞凋亡中的作用. 结果：共聚焦检测活细胞内钙离子的动态变化与 Caspase3 半胱氨酸蛋白酶中细胞
5、凋亡，使 HEC1B 细胞在活化过程中起了关键性的因素. 结论：HEC1B 对紫杉醇具有药物敏感性，紫杉醇对HEC1B 细胞的杀伤作用，是通过诱导细胞凋亡途径实现的.【关键词】 紫杉醇；子宫内膜肿瘤； 子宫内膜癌细胞珠； 增殖； 凋亡；caspase30 引言子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的 20%30%1. 在治疗方面一直沿用传统的手术、手术加放疗或激素治疗. 因此，疗效及治愈率无提高. 化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要作用，在晚期肿瘤的治疗中尤为重要. 近年来，EC 的发病率有明显上升趋势2，为了进一步提高子宫内
6、膜的疗效，探索紫杉醇对子宫内膜癌在临床上的应用提供理论及实验依据.紫杉醇(taxol，paclitaxe1)是一种新的抗微管药物. 紫杉醇作为抗癌药，对前列腺癌、乳腺癌等治疗已有广泛的应用. 新辅助化疗对子宫内膜癌的疗效不断肯定1，肿瘤的发生及发展是细胞无限制过度增殖的过程，化疗对肿瘤的作用应包括杀伤肿瘤和抑制肿瘤细胞分裂，增殖及促进调亡两方面. 本文探讨了新辅助化疗对 HEC1B 细胞调亡及增殖的影响，现报道如下.1 材料和方法1.1 材料1.1.1 细胞株从美国 American Type Culture Collection (ATCC)引进的HEC1B 细胞株购自中科院上海生命科学研究
7、院细胞所. 培养基：EMEM 培养基（美国 Gibco 公司）；血清：胎牛血清（杭州四季清）. 细胞培养：按照 ATCC提供的培养传代方法6培养于含 100 mL/L 胎牛血清、1.0 mmol/L 丙酮酸钠，1.0 mmol/L 非必需氨基酸和 1.5 g/L 碳酸氢钠的 EMEM 培养液中，在 37，50 mL/L CO2 培养箱中培养.1.1.2 药物与试剂抗体Taxol：北京四环医药科技股份有限公司产品; caspase3 多克隆抗体（Santa Cruz Biotec，CA USA）.1.1.3 细胞培养用品 EMEM 培养基：美国 Gibco 公司产品. 用时按说明用三蒸水配制，并
8、加入 100 mL/L 非必需氨基酸和 1.5 g/L 碳酸氢钠的 EMEM 培养液用 0.22 m 滤器除菌，4冰箱保存. 胎牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所生产. 胰蛋白酶：美国 Gibco 公司产品. 用无血清培养液配成 2.5 g/L 浓度，0.22 m 滤器除菌，4冰箱保存. 40 cm 培养皿：中间有 9 mm 小孔. Costar 公司产品. (以上试剂均购于博微生物科技有限公司).1.2 方法1.2.1 子宫内膜癌细胞株 HEC1BGIBCO EMEM 培养液中(含 100 mL/L 胎牛血清、100 m/mL 青霉素，100 m/mL 链霉素，丙酮酸钠 1.0 mmol/
9、L,非必需 1.0 mmol/L 氨基酸和 1.2 g/L 碳酸氢钠, pH 7.07.2 值)，于 37, 50 mL/L CO2培养箱中培养，每 48 h 换液一次，细胞呈单层贴壁生长，2.5 g/L 胰蛋白酶消化传代. 选用对数生长期细胞进行实验5-6.1.2.2 细胞增殖活力检测将贴壁细胞消化传代后计数，调整细胞浓度为1104/mL，接种于 24 孔培养板中，37，50 mL/L CO2 及饱和湿度条件下培养. 实验时分为 2，4，8，16，20 nmol/L 5 个药物浓度组及对照组，每组 5 个孔，细胞接种后 24 h 加药，分别于加药后 12，24，48，72 h 测定各孔的吸光
10、度值（A 值）. 测定前弃去培养孔上清后，每孔加 500 L 新配制的 5 g/L MTT，37继续孵育 4 h，弃上清加 150 L DMSO 溶解，混匀后用 DG3022 型酶标仪，在 490 nm 波长处测定细胞的光吸收值，并按肿瘤细胞抑制率(%)=(1-实验孔 A 值/对照孔 A 值)1005,7.1.2.3 采用细胞计数法取细胞生长期的细胞用 2.5 g/L 的胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度悬浮于新鲜含 100 mL/L 胎牛血清 EMEM 培养液接种细胞 1103 个细胞，40 cm 点孔直径为 9 mm 的 6 个培养皿里. 观察细胞贴壁后，每个培养皿紫杉醇的浓度分别为 2
11、, 4, 8, 16, 20 nmol/L，作用 48 h 后加入caspase3 抗体(按照 Santa Cruz 说明书 11001500)，观察细胞 Hoechet 染色，在激光共聚焦扫描(仪器的型号 MPC1024,美国 BTORAD 公司)，分析软件（TimeCouRSE Lasersharp）检测子宫内膜癌细胞凋亡和钙离子的浓度变化5,8-9.2 结果2.1 紫杉醇对 HEC1B 细胞，在接种 1 d，HEC1B 细胞生长稳定，2 d 细胞开始生长，并进入对数生长期，根据每日所测的 OD 值绘制生长曲线在对数生长期内正常子宫内膜癌 OD 值低于 1.5（P0.05）. 细胞群体倍增
12、时间为细胞生长曲线(图 1).2.2 紫杉醇对 HEC1B 细胞群体倍增时间为 32.7 h，从图 2 可见对照组在培养时间内生长呈上升趋势. 处理组在 13 d 内 HEC1B 细胞仍以增殖为主，在此期间 HEC1B 细胞的群体倍增时间延长为 48 h，但因药物对其生长的抑制作用，与对照组相比起增殖趋势明显减弱；在药物作用 34 d，HEC1B 细胞的增殖与药物抑制作用达到平衡，从生长曲线表现为平直的线段，HEC1B 细胞生长曲线表现为下降趋势，表明该药物对癌细胞的增殖抑制作用具有明显的持续效应（数据处理使用 SPSS 11.0 软件对数据进行处理，采用 Wilcoxon 秩和检验分析数椐，
13、P0.05 为有统计学意义.表 1 子宫内膜癌细胞在不同浓度作用下的细胞存活率（略）2.3 紫杉醇诱导 HEC1B 细胞凋亡，观察活性细胞内钙离子的动态变化紫杉醇与 Caspase3 诱导细胞凋亡，使 HEC1B 细胞在活化过程中起了关键性的因素(图 3). HEC1B 细胞(对照 A)，应用不同浓度的 Taxol 2， 4， 8， 16 及 20 nmo/L 在共聚焦下观察，作用 48 h 后 HEC1B 细胞见较多凋亡细胞小体(图 3B，C).AO/EB 荧光双染亦见到典型的呈绿色，固缩的早期凋亡细胞以及圆粒固缩的晚期凋亡细胞(图 3D，E)，细胞凋亡且呈时间依赖性(图 3F). 8 nm
14、ol/L 结果证明Taxel 在体外培养的 HEC1B 细胞诱导凋亡的能力及耐药性等奠定基础7. 图像经数字化输入计算机分析三维图函 f（x，y）进行分析，以获得所需要的数椐.3 讨论紫杉醇是一种新的抗微管药物1-2， Taxol 作为抗癌药，对前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等治疗已有广泛的应用. 目前临床上已应用于子宫内膜癌. Taxol 抗肿瘤药是 HEC1B 细胞凋亡的诱导剂，其细胞毒效应可能主要由于启动肿瘤细胞程序化死亡的通路. 共聚焦显微镜下扫描 HEC1B 细胞在 48 h 形态变化：胞核变圆，胞浆透亮，细胞成团，不同浓度紫杉醇作用 48 h 形态变化：HEC1B细胞明显的变弱，大量细胞
15、产生了凋亡. 由于它的高灵敏度和能观察空间结构的独特优点，从而对被检物体样品从停留到表面单层、静态平面的观察进展到立体、断层扫描、动态全面的观察，在生命科学研究中得到迅速应用. 其同时具备了普通显微镜和荧光显微镜的功能，并配有现代电子摄像笔微机数字图像分析系统，可将细胞变成“微小试管”，结晶和特异的荧光抗体进行一系列亚细胞水平的结构和功能的研究，是目前先进的细胞形态、功能研究的手段5，9-10. 还能做到侧定细胞内骨架蛋白，细胞内的浓度，膜电位，过氧化物，细胞间通讯等，还可进行细胞手术，细胞筛选及定量共聚焦三维图像分析，为活细胞功能的研究开辟了新的途径6.Caspase3 是最受重视的调控细胞
16、凋亡的基因家族；caspase3 的下调是紫杉醇诱导人子宫内膜癌细胞发生凋亡的重要条件. Taxol 目前主要用于治疗对常规化疗无效的卵巢癌和乳腺癌，其作用是与微管结合使微管稳定性增强，抑制微管解聚，使细胞阻滞于分裂期，并促进细胞凋亡11. 在白血病及卵巢癌细胞的体外实验中， 紫杉醇的细胞毒作用与其诱发细胞凋亡有关12. 紫杉醇用于人子宫内膜癌治疗，对各种进展期的人子宫内膜癌有缓解作用，在人子宫内膜癌的有效率最高可达 80%1. 本文结果发现紫杉醇能抑制 HEC1B 细胞生长，诱导细胞凋亡，且这些作用具有明显的剂量效应与时间效应. 根据体外细胞毒性实验，该药在一定剂量范围内（预实验 21000 nmol/L，实验 210 nmol/L）呈明显的浓度/时间生长抑制依赖性. 在本实验中，220 nmol/L 的Taxol 作用于 HEC1B 细胞 12 h，未显示出明显的增殖作用，随作用时间延长，在
