《膀胱癌和肾癌中RASSF1A和BLU的甲基化状态【临床医学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《膀胱癌和肾癌中RASSF1A和BLU的甲基化状态【临床医学论文】（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、临床医学论文-膀胱癌和肾癌中 RASSF1A 和 BLU 的甲基化状态【摘要】 目的 探讨 RASSF1A 和 BLU 在膀胱癌和肾癌中启动子甲基化状态及其意义。方法 采用甲基化特异性 PCR (MSP) 技术分别在 45 例膀胱癌组织和相应癌周正常组织、12 例肾癌组织及其相应癌周正常组织和 3 例非肿瘤患者正常膀胱组织中检测 RASSF1A 和 BLU 启动子区域的甲基化状态。结果 膀胱癌组织中，RASSF1A 和 BLU 甲基化率分别为 55.6% 和 31.5%; 肾癌组织中, 两基因甲基化率为 66.7% 和 33.3%。RASSF1A 和 BLU 启动子甲基化状态与膀胱癌临床病理参
2、数无明显相关性(P0.05)。在膀胱癌或肾癌中，RASSF1A 和 BLU 启动子甲基化状态之间均无明显相关性(P0.05)。 结论 膀胱癌和肾癌中,RASSF1A 和BLU 频繁发生高甲基化，高甲基化可能参与膀胱癌和肾癌两类肿瘤的发生。 【关键词】 膀胱癌 肾癌 RASSF1A BLU 高甲基化【Abstract】 Objectives To investigate the promoter methylation status of RASSF1A and BLU in bladder carcinoma and renal carcinoma and their significance
3、. Methods The methylation status of promoter of RASSF1A and BLU were examined by MSP in 54 cases of bladder carcinoma tissues and adjacent normal tissues from 45 cases, 12 cases of renal carcinoma tissues and adjacent normal tissues and 3 cases of normal bladder tissues from noncancerous patients. R
4、esults Hypermethylation of RASSF1A and BLU was detected in 55.6% and 31.5% of bladder carcinoma tissues, retrospectively. In renal carcinoma tissues, hypermethylation of RASSF1A and BLU was detected in 66.7% and 33.3%, respectively. No association between the methylation status of RASSF1A and BLU wi
5、th the clinical pathological parameters of bladder carcinoma was found (P0.05), neither was it found between the methylation status of RASSF1A and BLU in bladder carcinoma or renal carcinoma (P0.05). Conclusions RASSF1A and BLU are found with frequent hypermethylation in bladder carcinoma and renal
6、carcinoma，which may be involved in tumorigenesis.【Key Words】 Bladder carcinoma Renal carcinoma RASSF1A BLU Hypermethylation 2000 年，Lerman 等在 3p21.3 区域内 120kb 长的肺癌最小纯合缺失区鉴定了 8 个基因，其中包括 RASSF1 和 BLU。研究发现，RASSF1 常见转录本RASSF1A 和 BLU 在包括肺癌、乳腺癌、鼻咽癌等常见肿瘤细胞系和癌组织中转录表达异常下调，启动子高甲基化，且点突变率极低，推测它们可能是新的肺癌候选 TSGs。本研
7、究，通过检测候选抑癌基因 RASSF1A 和 BLU 在膀胱癌和肾癌中启动子甲基化状态，探讨 RASSFIA 和 BLU 两基因与膀胱癌和肾癌发生发展的关系。1 材料与方法1.1 研究对象 收集 2004 年 3 月至 2005 年 5 月 45 例膀胱移行细胞癌患者膀胱切除标本的癌组织及相应的癌周正常组织(男 36 例,女 9 例,年龄 3083 岁，平均 62 岁)，3 例手术切除的非肿瘤患者正常膀胱组织，12 例手术切除的肾透明细胞癌患者癌组织及相应的癌周正常组织(男 9 例,女 3 例,年龄 3975 岁,平均 56 岁)。所有标本由同济大学附属第十人民医院(第一作者读研究性时实习医院
8、)和上海市第一人民医院分院泌尿外科提供。膀胱切除术切除的膀胱癌组织标本病理分级按 WHO 方法：级 27 例，级 11 例，级 7 例 ；临床分期按 UICC 标准：TaT1 期 31 例，T2T3 期 14 例。1.2 组织 DNA 的抽提 严格按照 Wizard Genomic DNA Purfication Kit (Promega 公司) 试剂盒说明书抽提 DNA，用紫外分光光度仪定量。1.3 DNA 的亚硫酸氢盐修饰和 MSP 技术 采用基因组 DNA 修饰试剂盒 CpGenome DNA Modification Kit (Serelogical 公司)，取 1g DNA 按说明书
9、操作步骤进行修饰。以修饰后 DNA作为模板,分别利用甲基化和非甲基化特异性引物进行热启动 PCR 扩增(引物序列及扩增条件见表 1)，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。取10l 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,GIS 凝胶图像处理系统分析结果。表 1 MSP 引物序列及扩增条件（略）注：MF 代表甲基化特异性上游引物；MR 代表甲基化特异性下游引物；UF 代表未甲基化特异性上游引物；UR 代表未甲基化特异性下游引物1.4 PCR 产物克隆和测序 随机挑选甲基化和未甲基化的 4 份 PCR 产物，TA 克隆后进行测序，测序引物为 M13 通用引物，测序仪为 ABI 377 型测序仪。1.5
10、统计学分析 采用 SPSS 11.0 统计软件包处理数据，进行 2 检验或四格表精确检验。以 P0.05)，见图 1。表 2 膀胱癌组织 RASSF1A 和 BLU基因甲基化与临床病理特征之间的关系（略）2.2 克隆测序结果 见图 2。3 讨论RASSF1A 是 RASSF1 最常见的转录之一，cDNA 全长 1873bp，编码含 340 个氨基酸的蛋白质，由于其核苷酸序列的羧基端与小鼠 Ras 效应蛋白 Nore1 高度同源而得名。在包括肺癌、乳腺癌、肾癌、宫颈癌等常见肿瘤中发现 RASSF1A启动子高甲基化和转录失活，且高甲基化与转录失活密切相关，体内及体外实验己表明 RASSF1A 可抑
11、制肿瘤细胞系的生长，从而将其确定为 3p21.3 区域主要的侯选 TSG，6。在膀胱癌中，有学者对 RASSF1A 基因展开了研究，并得出了相似的结果，但目前该基因异常改变与肿瘤临床病理参数相关性结论并不一致，。本研究结果表明，在膀胱癌中 RASSF1A 基因启动子频繁发生高甲基化改变，提示该基因甲基化可能与肿瘤的发生相关；虽然甲基化与肿瘤临床病理参数无显着相关性, 但由于在级和 TaT1 期肿瘤中基因甲基化率均较高，结合本资料1 例癌周正常组织中也发现基因甲基化改变，提示 RASSF1A 基因甲基化可能参与了该肿瘤发生的早期阶段，有望成为膀胱癌早期诊断的有用指标。在部分癌组织中，琼脂糖电泳同
12、时检测到甲基化和未甲基化条带，这一方面可能因为两条等位基因中存在未甲基化等位基因，另一方面可能因为肿瘤细胞中难免有正常细胞污染。BLU 基因位于 RASSF1 基因的上游，在蛋白分子的羧基端含有一个 DNA 结合功能域MYND 锌指功能域，该功能域同样位于 AML/ETO、BS69、suppression等蛋白内，这些蛋白分子分别在转录抑制、病毒癌蛋白结合，以及细胞周期调控等方面发挥作用，。研究证实，MYND 功能域对这些蛋白功能的发挥是必须的，MYND 功能域的存在暗示 BLU 基因可能同样参与了重要的转录调节途径。BLU 基因最初被鉴定为一种候选肺癌 TSG。随后的研究发现，BLU 基因在
13、肺癌、乳腺癌、肾癌和神经母细胞瘤等癌细胞系中启动子区域高甲基化和转录水平明显下调，给予表达下调的部分肺癌和鼻咽癌细胞系，甲基化抑制剂后，表达能部分或完全恢复，该基因的外生性表达能有效抑制神经母细胞瘤和非小细胞肺癌的克隆形成，由此推测 BLU 基因可能是多种肿瘤的侯选TSG。在膀胱癌中，有关 BLU 基因的相关研究尚未见有文献报道，该基因在膀胱癌发生发展过程中的作用仍不清楚。本研究发现 BLU 基因在膀胱癌中发生一定频率的高甲基化改变，基因甲基化率与肿瘤临床病理参数无显着相关性，实验结果与 RASSF1A 相似，但是有随着组织分级和病理分期升高的趋势，故认为 BLU 基因启动子高甲基化可能参与了
14、膀胱癌发生的早期阶段，但与肿瘤发展预后的关系仍不明确。除了膀胱癌，此次研究在 12 例肾癌组织中同样发现 RASSF1A 和 BLU 一定频率的高甲基化改变，推测 RASSF1A 和 BLU 基因启动子高甲基化可能参与了肾癌的发生。但是本组肾癌组织标本较少，尚需扩大标本作进一步研究。BLU 和 RASSF1A 是位于同一染色体区域内的两相邻基因。Agathanggelou 等研究发现小细胞性肺癌和鼻咽癌组织中 RASSF1A和 BLU 甲基化状态之间并无相关性(P0.05)，由此认为 BLU 启动子高甲基化可能是一类独立事件，并非染色体 3p21.3 区域甲基化的结果。本研究结果表明，膀胱癌和
15、肾癌组织中 BLU 甲基化率均较 RASSF1A 低，但二者甲基化率之间的差异并无统计学意义(P0.05)，支持上述结论，同时认为 RASSF1A 基因高甲基化可能也是一独立事件。综上所述，本研究结果显示 RASSF1A 和 BLU 是膀胱癌和肾癌甲基化谱成员之一，可能参与了该两类肿瘤的发生，但是甲基化的具体机制，甲基化与肿瘤临床病理参数的相关性，甲基化与基因转录失活的关系等若干问题，仍有待更深入的研究。 【参考文献】1 Lerman MI, Minna JD. The 630-kb lung cancer homozygous deletion region on human chromos
16、ome 3p21.3: identification and evaluation of the resident candidate tumor suppressor genes. Cancer Res, 2000, 60(21):61166133.2 Dammann R, Li C, Yoon JH, et al. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from lung tumor suppressor locus 3p21.3. Nat Genet, 2000, 25 (3):315319.3 Braga EA, Kashuba VI, Maliukova AV, et al. New tumor suppressor genes in
