课题申报书-细胞信号时空动态的前沿研究和关键技术

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1、项目名称： 细胞信号时空动态的前沿研究和关键技术首席科学家： 王世强 北京大学起止年限： 2011.1 至 2015.8依托部门： 教育部二、预期目标本项目的总体目标： 我们将在深入分析细胞钙信号、线粒体 ROS 信号与关键蛋白的时空动态活动的基础上，运用实验分析和理论建模相结合的方法系统地分析信号间相互调节、相互控制的关系，阐明细胞信号微观随机动态呈 现系统稳态的基本原理，并有重点地揭示有关病理条件下信号系统失稳态的机制，为基于细胞信号的药物创新提供理论基础。同时，根据研究需求，建立并完善的细胞时空动态实验研究体系， 发展新型显微成像平台，建立和培养一支高水平的多学科研究队伍，为保持和不断提

2、升我国在该领域的研究的水平和国际影响力奠定可持续发展的基础。五年预期目标: 1. 在现 有的基 础上，建立完善的信号时空动态实验体系，重点加强高分辨、新模态显微成像和分子探针平台，发展显微图像实时处理和三维重构技术，争取实现若干关键技术的自主创新；2. 阐 明细胞钙信号纳米尺度局部控制机制和钙稳态维持条件。在有代表性的病理条件下（例如交感紧张造成的肾上腺素受体过度激动），研究钙信号时空动态的异常，阐明其失稳态的机制；3. 定量研究细胞 ROS 爆发产生超氧炫的动态过程，揭示 ROS 信号稳态维持与细胞钙稳态、关键信号蛋白的相互调控关系，以及在有代表性的病理条件下ROS 动态的异常、ROS 与钙

3、失稳态的交互作用以及相关信号蛋白的作用；4 在 实验数据的基 础上，建立细胞信号反应扩散模型和随机 链模型，系 统研究细胞钙信号、ROS 信号系统和关键蛋白的微观随机行为整合为系统稳健性的基本原理，提出基于细胞信号的控制理论和优化理论。5. 培养 硕士博士研究生 6080 名，博士后 1020 名，国家杰出青年基金 获得者、教育部“”、中科院“百人计划”等学术带头人 4-8 名。从而造就一批在细胞信号时空动态研究领域有国际竞争力的优秀中青年科学家和后备人才，建设一支结构合理、具备攻坚能力的国际水平研究队伍；6主 办 12 次细胞信号动态国际学术会议， 强化我国在 该领域的国际学术地位；7. 研

4、究成果主要以研究论文和独立开发的技术成果（专利）形式公布，五年内争取发表 SCI 论 文 100 篇，其中相关领域主流学术期刊不少于 40%，力争在Cell、Nature 或 Science 上发表论文，并申 报专利 10 项。三、研究方案1. 总体学术思路： 首先，我们基于以往突破性进展的基础， 继续深入研究细胞钙信号和超氧炫的时空动态及其调控机制。 这些调控机制必然涉及相关信号通路一些关键蛋白，我们将通过对这些蛋白分子动态和相互作用的研究深入地阐明它们与钙信号和ROS 信号系统的相互调控。这三个方面在思路上以分析为主。在上述分析的基础上，我们将通过两种方式进行整合研究。一方面是针对参与钙信

5、号和 ROS 相互作用的关键蛋白，利用基因敲除、定点突 变等遗传干预手段“牵一发而动 全身” ，通过单因素变化导致的多因素变化来推断多信号体系内的调控关系；另一方面在大量时空动态实验数据的基础上构建数学模型，从控制原理和优化理论的角度研究系统的性质，揭示微观随机信号形成系统稳健性的原理。细胞信号时空动态研究很大程度上依赖研究技术的进步。我们的前沿探索将对显微成像技术、分子探 针、多 维图像算法等提出 较高的需求，因此将 发挥项目组成员的多学科优势实现新模态、高分辨、高通量成像技术的自主创新。2. 技术路线及可行性： 本项目将采取多学科相互交叉、渗透和有机结合的途径，重点围绕钙信号和ROS 信号

6、时空动态关系，研究关键信号蛋白如何相互作用实现稳态这一关键科学问题， 结合分子探针、显微成像关键技术的完善与 发展，系 统地开展跨学科的基础研究。细胞信号成像将采用激光共聚焦显微成像系统。在需要较高时间分辨率的研究中采用高速共聚焦系统，数据采集速率可达 1001000 帧/秒，细胞的三维扫描可在 1 秒中完成。我 们将自行研制 STED 系统用于空间高分辨成像，研制CARS 和 SRS 系统用于非荧光探针成像。为了高效率处理大量多维图像数据，我们将发展经验性数据驱动(empirical, data-driven)分析方法，利用主成分分析进行数据降维，把降维后的数据投射到一个 Langevin

7、方程上，衍生出一系列小规模的动力系统。用独立成分分析以及去卷积计算细胞信号的时空序列。在关键信号蛋白的研究中，我们将利用在分子生物学、细胞生物学以及生物化学方面的良好工作基础，根据项目对信号蛋白的观测需求，采用不同技术途径实现信号蛋白及其相互作用的可视化。我们将在“ 大肠杆菌- 哺乳细胞” 穿梭体系和分子进化平台的基础之上，构建新颖的高通量变异体筛选库，实现非天然氨基酸分子标记。我们还将设计 具有特殊光学性质的荧光蛋白、pHluorin与信号蛋白的表达体系，进行稳定遗传 。开展小分子信使（如离子、 ROS等）的检测及其生物学功能研究；发展SRET技术， 实现检测多个蛋白相互作用的调控机理研究。

8、由于在心脏细胞等高度分化的细胞表达分子探针还有相当的困难，我们将先用细胞株和植物细胞进行筛选，条件成熟的探针可以构建腺病毒或慢病毒转染表达体系。通过系统优化，我们将推动探针技术成为实验 室常规技术， 实现对信号蛋白及其相互作用的高时空分辨探测。为深入阐述信号微观随机动态与系统稳态的相互关系，我们将在多种尺度上开展研究。在分子水平上，研究重要信号蛋白的动态 行为及相互作用；在细胞器水平上，研究钙信号、ROS 信号的动态及其与信号蛋白的相互作用；在细胞水平上，研究钙信号螺旋波，钙信号与 ROS 信号相互作用，信号蛋白的空间定位和调控网络等；在整体水平上，将采用基因敲除鼠和转基因鼠方法，研究信号蛋白

9、的功能及其整合调控关系。我 们既在离体细胞内研究信使分子的时空动态和信号转导，也在动物活体上观测 分子信号的动态，将离体与在体研究相统一。通过数学建模，将实验事实与生物学规律联系起来，通过对数据的拟合，建立细胞信使动态和稳态相统一的理论模型。虽然系统的维数很大，但是通常只有几个反应是限速的(rate-limiting )。我 们可以通过限速反应、或某些 “限速”的网络模块(module)，发展基于信号传递或信息流的网络 分解方法。 我们将基于反应扩散型偏微分方程、Ginzburg-Landau 非线性偏微分方程等建立心肌 细胞钙信号螺旋波的数学模型，开展对螺旋 钙波动力学行为的研究。以单分子米

10、氏方程为基础建立单分子反应模型，进一步建立分子寡聚体系的数学动力学模型，通过 Monte Carlo 仿真 获 得分子寡聚体系动态行为。我们将推广 谢晓亮的单分子米氏方程理论，建立包含多类分子的反 应通路的动力学，然后 发 展多尺度分子交互系统的理论。本项目提托中关村地区的学术环境优势，发挥综合大学的多学科攻关优势，利用多个国家级研究基地的资源优势，包括生物膜与膜生物工程国家重点实验室、分子科学国家实验室、生物大分子国家重点实验室等。因此，本 项目承担单位具有良好的研究条件和研究基础。承担本项目研究工作的中坚力量都是细胞信号动态研究、分子探针研究、新一代显微成像和多维图像处理等相关领域的学术带

11、头人，拥有卓著的研究成果和丰富的研究经验，部分成 员的研究在国际同领域居主导地位。更为重要的是，本项目成员多年来保持密切交流和合作，不仅多次召开学术研讨会，还产生了多项重要合作研究成果。为本 项目攻关提供了强强联合、优势互补的学术团队。3. 创新点与特色： 本项目是根据国际研究前沿和热点，结合我国在细胞信号时空动态研究的特色和优势，针对可能获得突破的关键科学问题而提出的。其创新性主要体现在：（1）研究目标的创新。本项目拟解决的关键科学问题是微观随机信号整合成细胞调控稳态的基本原理。 这是基于我们以往对细胞信号随机动态的深入研究，经过多次跨学科研讨，凝练 出的科学问题，是生命科学、系 统与控制科

12、学、非线性物理科学领域共同关心的基本问题。（2）研究思路的创新。细胞信号过程是一个多层次复杂、动态体系。深入研究这一动态体系中细胞信号的相互作用规律需要整合不同学科的优势。我们在总体研究思路上，实验与理论 相结合、分析与 综合相结 合、微 观与宏观相结合、离体与在体相结合、随机与稳态 相结合、科学探索与技术创新相结合。用不同思路、从不同角度进攻同一关键问题。（3）研究方法的创新。研究细胞信号激活的时间、空间、幅度以及与上下游信号分子相互作用有很大的技术难度。要获得突破性进展，很大程度上依赖于建立新技术和新方法。本项目将充分利用项目组成员的研究特长，建立和发展高分辨率显微成像技术、基于拉曼光 谱

13、的新模态显微成像技术、基于非天然氨基酸的蛋白质标记技术、基于荧光蛋白的信号分子探针技术、光激活荧光蛋白及蛋白相互作用的动态检测技术、基因打靶技术、 RNA 干扰技术等新的综合平台，为深入揭示细胞信号时空动态创造得天独厚的实验条件。本项目的显著特色是多学科联合攻关。本项目的主要研究骨干来自北京大学生命科学学院、工学院、化学学院、数学学院，中科院生物物理所，中科院植物所，北京师范大学和中南民族大学，汇聚了来自细胞生物学、生物物理学、分子生物学、生物信息学、化学、光学、数学、工学等多学科的专家，联合组成跨学科攻关团队。团队中，生命科学专家提出关于生命活动信号调控的基本问题，并从分子、细胞到整体进行实

14、验研究；长期致力于生命过程研究的数学家以实验数据为基础，通过抽象、建模、仿真，对细胞信号时空过程的稳态机制进行理论升华；化学生物学家通过设计分子探针，实现信号分子的动态和相互作用研究；来自工学院的专家一方面为项目中成像技术和数据分析提供支撑，也将产生研究技术的自主创新成果。4. 课题设置本项目围绕总体目标，设立六个课题组：课题 1 细胞钙 信号的时空特异性 调控研究内容：通过过去三十多年的不懈探索，细胞钙信号的微观性质已经逐步阐明，但 这些信号如何控制并产生复杂的胞内动态行为尚知之甚少，限制了对有关生理和病理过程的深入认识。为此，本 课题主要研究 细胞钙信号的微观控制和时空自组织过程，包括钙火

15、花发生过程中 L 型钙通道与钙释放通道间纳米尺度局部控制、钙火花通过钙致钙释放自激形成螺旋钙波和钙振荡的时空动态，同时与课题二合作研究细胞钙信号时空动态与超氧信号的相互关系。研究目标：本课题的总体目标是阐明细胞钙信号纳米尺度局部控制机制和细胞钙信号自组织机制， 阐明单线态氧分子等超氧信号与细胞钙振荡的相互作用，从而对细胞钙信号异常如何导致心律失常等重大疾病这一长期未能阐明的问题提供新的分子病理机制。承担单位：北京大学、北京师范大学课题组长：王世强学术骨干：崔宗杰经费比例：20%课题 2 超氧炫与 细胞 ROS 信号时空动态 研究内容：ROS 信号与细胞信号通路调节、 应激反 应、衰老、凋亡以及

16、多种疾病密切相关，在生理和病理条件下都发挥重要作用。尽管 ROS 信号研究历史悠久，制约 ROS 信号动态 研究的主要原因是缺少特异性好、灵敏度高的ROS 探针。我 们最新研究 发明了一种特异于超氧阴离子的荧光蛋白探针cpYFP，利用 该定位于线粒体的超氧阴离子荧光探 针，我 们发现了新的线粒体超氧生成事件，并命名“超氧炫 (superoxide flash)”。本研究将在此研究成果基础上，进一步发展在体实时探测 ROS 技术，并 结合代谢 模式转变的疾病动物模型，深入探讨 ROS 信号时空特性及其分子调控机制，从新的视野研究 ROS 信号的病理生理意义。研究目标：以超氧炫信号为基础，在整体动物水平实时监测正常生理代谢过程及有关病理过程中 ROS 信号的变化及其作用机制，探讨超氧炫信号用于诊断的可行性。承担单位：北京大学课题组长：张 晨学术骨干：程和平、吴蓓经费比例：16%课题 3 钙和 ROS 通路关 键信号蛋白的可视化分析研究内容：本课题将以细胞内的关键信号转导蛋白为研究对