《课题申报书-用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能》由会员分享，可在线阅读，更多相关《课题申报书-用慢病毒RNA干扰系统研究精子发生相关基因znf230的功能（27页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、摘要：项目研究内容和意义简介（限 400 字）： RNA干扰（RNA interference,RNAi）是由双链 RNA介导的序列特异性的 mRNA降解所致的转录后基因沉默过程。RNAi 技术可方便快捷地研究基因的功能，并用于功能基因的筛选。本课题拟采用 RNAi及胚胎干细胞体外定向分化技术，将我室新克隆的精子发生相关基因 znf230的 siRNA通过慢病毒（Lentivirus）系统引入小鼠胚胎干细胞，体外模拟精子发生过程，而在细胞水平上研究 znf230基因表达受抑后对生精的影响，同时结合基因表达谱芯片及蛋白组二维电泳-质谱技术实现基因功能性及蛋白质表达筛查，以期全面研究该基因的功能。
2、上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为 RNAi技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定表型且异常表达的基因功能研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1. 项目的立项依据（ 附主要的参考文献目 录 ）人类基因图谱解码已经完成。进入功能基因组学时代后，疾病相关基因以及重要功能基因的分离、定位、克隆表达已日益加速。而随着新基因的分离与鉴定，对这些基因的功能进行系统的研究将成为这一时期的主要任务。因此，建立或开发新的或实用的基因功能研究技
3、术平台具有重要意义。在功能基因组研究中，酵母杂交系统、DNA 芯片、反义 RNA、基因敲除(gene knock-out)等技术为解读基因功能提供了有效的手段。其中基因敲除虽是基因功能研究的经典技术 1，但由于外源及靶 DNA 发生同源重组的几率极低，重组体的筛选及检测即成为该技术的瓶颈，难以适应大规模的基因功能研究。近年来发展起来的 RNA 干扰(RNA interference，RNAi)技术作为特异性抑制基因表达的方法，已成为生命科学领域研究的热点。其优点是可以简便地制备特定基因缺失表型的个体，较快捷地研究目的基因的功能，并使系统性、高通量功能基因筛选成为可能。RNAi 现象首先在秀丽新
4、小杆线虫(C.elegans)中被发现。它通过双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)介导的同源靶 mRNA 的特异性降解，在转录后水平使基因沉默(Post Transcriptional Gene Silencing, PTGS)2,3。RNAi 技术现已成功运用于线虫、果蝇、植物、真菌和脊椎动物等生物体的功能研究中 4,5，而在哺乳动物细胞内转染 21-25 nt 长度的 siRNA 也可以诱导特异性的基因沉默 6，虽然这种效应具有瞬时性。目前，多个研究小组 7-10已将靶向特异基因的shRNA 表达质粒导入细胞，在聚合酶依赖性 H1 或 U6 启动子控制下获
5、得siRNAs 的持续表达并导致了靶基因特异、持续的下调，这为 RNAi 用于长期功能缺失型研究提供了新的思路。然而，目前在 RNAi 应用研究中仍存在如下一些问题亟待解决，如：1) shRNA 表达载体对某些靶基因虽能取得较明显的 RNAi 效应，但多数仍呈瞬时性，且受到转染效率、细胞类型等因素的限制，难以获得长期的“knockdown”效应。2）并非所有的组织或细胞的靶基因对 RNAi 敏感；某些基因的表型鉴定本身就存在困难，一定条件下需用特定的基因传递系统在模型中加以证实。3）目的基因序列上 siRNA 模板的选择无统一标准。实际操作中往往是试探性的，选择不同序列 RNAi 效应差别大，
6、抑制率可从 090 不等。因此，建立高效、稳定长期表达的 RNAi 传递系统正是该领域目前研究的关键。虽然逆转录病毒的运用能有效地降低靶基因的表达 11，但 MMLV 类病毒自身特点及对细胞类型的选择性使其应用受到一定的限制。当前，新型第三代慢病毒(Lentivirus)系统正以其高效、稳定的特性在 RNAi 研究中倍受关注。Lentivirus 来源于 HIV-1 病毒，其宿主细胞范围广泛，包括分裂细胞、非分裂细胞、原始细胞等，且转基因在生殖系统中可稳定传递 12,13。Pfeifer 14等的研究结果表明，Lentivirus 介导的转基因均可在鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem,
7、 ES)体内、外分化过程中表达，将 Lentivirus 感染的 ES 细胞注入胚泡期或桑椹期胚胎，发育的新生鼠及其子代的多种组织中均可检测到转基因。Tiscornia 15等将沉默GFP 的 Lentivirus 感染 GFP 阳性转基因鼠卵细胞，发现新生鼠体内 GFP 荧光蛋白的表达明显降低。Rubison 16等运用 CD8/CD25 siRNA 的 Lentivirus 载体转染鼠 ES 细胞，生成了 “knockdown”转基因鼠，其效应维持长达 30 天之久并可传递下一代，充分显示了该方法的优越性。精子发生是一个复杂的多阶段的细胞分化过程，涉及生精细胞的生长、分裂、分化和信号传递等
8、，要求一系列基因表达的精确调控 17,18。这些基因的异常将导致精子发生障碍，表现为寡精症或无精症。近年来我室分离克隆了一系列可能与精子发生相关的基因 19-22，目前已初步阐明了这些基因的结构与表达，如 ZNF230 在无精症患者睾丸组织中无表达，znf230 在小鼠睾丸内特异表达且可能在精细胞(spermatid)形成阶段起重要作用 22。由于生精过程极其复杂，这些基因的调控及其生物学功能尚未明了。为探索此类问题，首先需建立供研究的模型系统。2003 年末，Toshiaki Noce 研究小组 23成功地将小鼠 ES 细胞在体外定向分化成精子。研究中，悬浮培养的 ES 细胞在 BMP4 刺
9、激及拟胚体立体空间构型的影响下向原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)分化，具 PGCs性质的 ES 细胞 aggregation 移植至裸鼠的睾丸囊中即可发育成成熟的精子。此外，Daley 及 Geijsen 等研究小组 24也报道了 ES 细胞体外分化成精子的新进展。基于以上 RNAi 研究所取得的成果，结合鼠 ES 细胞体外定向分化新技术，我们设想如能将 Lentivirus 系统引入小鼠 ES 细胞使之长期稳定表达、发挥RNAi 效应，则可模拟兴趣基因在特定疾病中的异常表达情况，进而确定其功能。因此，可将 ES 细胞在体外定向分化成精子，即体外模拟精子发
10、生过程，在细胞水平上研究某一精子发生相关基因表达受抑后对生精的影响，以期全面研究该基因的功能。鉴于此，本课题在前期研究工作的基础上，拟运用生物信息学及 RNAi 载体构建新技术对我室新克隆的基因 znf230(GenBank ID:AF353167)进行有效siRNA 序列筛选、靶位证实，生成高效表达的 Lentivirus 载体系统并引入小鼠ES 细胞，阻断 znf230 的表达 (6 个有效的 shRNA 串联片段使 RNAi 抑制率至少达 90以上)。在精子体外分化模型的细胞水平上，为了有效地获取精子发生过程中 znf230 相关基因的表达、网络调控及其功能信息，将结合基因表达谱芯片技术
11、的高通量、快速、敏捷、平行性等特点，对照研究 znf230 表达被抑后表达谱的变化，以实现高通量的基因功能性筛查；同时运用经典的蛋白组学二维电泳-质谱技术来研究 znf230 被抑制后的蛋白表达变化，实现对蛋白质的表达进行原位筛查，以期分离鉴定有功能意义的蛋白。目前国内对 RNAi 的研究刚刚起步，我们利用 Lentivirus RNAi 系统建立的znf230 基因功能研究方法，在设计理论与技术上均与国际上的有关研究位于同一起点。上述技术平台的建立将提供一个精子发生相关基因功能研究的模型，亦为 RNAi 技术的应用研究拓展了新的思路。这一设想尚未见文献报道，如能证明其合理有效，将成为难于鉴定
12、表型且异常表达的基因功能研究的通用模型，并在后续蛋白组学及基因相关药物的研发中发挥重要作用。参考文献1. Lockhart PJ, OFarrell CA, Farrer MJ. Its a double knock-out! The quaking mouse is a spontaneous deletion of parkin and parkin co-regulated gene (PACRG). Mov Disord, 2004, 19(1):101-104.2. Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, and Bartel DP. RNAi: Double-
13、stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell, 2000, 101:25-33.3. Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophia cells. Nature, 2000, 404:293-296.4. Ravi S. Kamath, Andre
14、w G. Fraser, Yan Dong, et al. Systematic functional analysis of the caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature, 2003, 421(16):231-237.5. Carmell MA, Zhang L, Conklin DS, et al. Germline transmission of RNAi in mice. Nat Struct Biol, 2003, 10(2):91-92.6. Patrick J. Paddison, Amy A. Caudy, and G
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