《急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究【临床医学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究【临床医学论文】（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、临床医学论文-急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病的检测与临床意义的研究作者:任海全，唐天华，毕可红，张玉昆，赵良玉，郭桂月，刘秀兰，姜枫勤，刘传芳，彭军，田志刚摘要 目的 检测完全缓解后急性早幼粒细胞白血病患者微小残留病(MRD)，同时分析其对预后判断的指导价值。方法 建立逆转录 PCR(RT/PCR)用以检测APL 患者 PML/RAR。结果 RT-PCR 方法敏感而可重复。治疗前 APL 患者的 RT-PCR 阳性率为 92.8%(39/42)，而维甲酸或化疗诱导完全缓解后 MRD 阳性率为56.7%(21/37)。另外，MRD 阳性与缓解后 APL 患者的复发有关，并可以作为缓解后预测
2、APL 患者复发的指标。同时有助于指导临床上采取巩固治疗而防止复发。结论 RT-PCR 能够检测 APL 患者的 MRD 和作为预测复发的指标。关键词 急性早幼粒细胞白血病；微小残留病；RT/PCR白血病患者完全缓解（CR）后的微小残留病（MRD）已被证实与复发有关1。MRD 的检测也成为指导缓解后进一步化疗的重要指标2。在目前血液病的应用实践中，MRD 检测的最好例子是骨髓移植后 RT-PCR 法检测慢性粒细胞白血病（CML）的 BCR-ABL 融合基因3。急性早幼粒细胞性白血病（APL）以特异的染色体 t（15;17）（q22;q21）易位为特征4。最近，许多实验室发现 t（15;17）易
3、位后，通过 15 染色体上的 PML 基因和 17 染色体上的 RAR 基因并列而导致融合基因 PML/RAR 形成5。根据 PML 断裂点的位置不同，可以产生 2 个主要的 PML/RAR 异构体。断裂点位于 PML 内含子 3 或 4（bcr3），则 PML 外显子 3（P3）和 RAR 外显子3（r3）之间形成短（S）型融合 mRNA 产物，而断裂点位于 PML 内含子6（bcr1）或下游，PML 内含子 6（P6）和 RAR 外显子（r3）形成长（L）型融合体6，7。RT-PCR 法的建立正是依赖于断裂点的位置而设计适当寡核苷酸引物，继而扩增 PML/RARmRNA 异构体8。另外，R
4、T-PCR 的高度敏感性使得 MRD 的检测成为可能，并可在 APL 患者临床缓解期时早期预测白血病的复发。1 资料与方法1.1 病例选择 本研究中的 42 例患者均为 19932000 年发病，男 26 例，女 16 例，年龄 1272 岁，根据 FAB 标准9诊断为 APL。全部病例均经全反式维甲酸（ATRA）治疗3060mg/（m2d）诱导缓解。巩固化疗方案为标准的 HOAP 或 DA 方案。巩固治疗后处于缓解期的患者采用全国维甲酸协作治疗组建议的 ATRA 与化疗联合治疗方案维持治疗10。骨髓单个核细胞用Ficoll 分离并保存于液氮中。1.2 RNA 提取 10ml 淋巴细胞分离液加
5、于试管中，然后 2ml 骨髓细胞缓慢加入试管中，离心 4000r/min 20min。取单个核细胞移入另一试管中，再用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法抽提 RNAs11。提取时注意避免样品间的交叉污染。1.3 筑巢式 RT-PCR 检测 APL 的 PML/RAR 检测方法：8 个寡核苷酸引物用于逆转录、扩增，检测其长或短型异构体。逆转录引物：A 5-TGGATGCTGCGGCGGAAGAAGCCCTTGCAG-3PML/RAR 引物：B 5-GTCATAGGAAGTGAGGTCTTC-3C5-CCGATGGCTTCGACGAGTTC-3 D5-CTCACAGGCGCTGACCCCAT-3E5-AA
6、CAGCAACCACGTGGCCAG-3F5-TTCAAGGTGCGCCTGCAGGA-3 G5-AGCCTGAGGACTTGTCCTGA-3H5-GCTGCTCTGGGTCTCAAT-3正常 RAR 转录引物：I5-GCCTCCCTACGCCTTCTTCTTCT-3 J5-AAAGCAAGGCTTGTAGATGC-3 K5-GACCACTCTCCAGCACCA-3L5-GCTGGGCACTATCTCTTCAGAACT-3 RT-PCR 方法与步骤按照早期报道的方法进行12。1.4 PCR 产物分析 取 10l 第 2 轮 PCR 产物在 1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭 1g/ml 染色，照
7、相。并移至尼龙膜上，用 5 末端寡核苷酸探针（H）杂交，放射自显影 30min，拍片。1.5 统计学方法 采用 t 检验。2 结果2.1 PCR 产物的结果及其敏感度 PML/RAR 的 L、S 异构型（见图 1）。RT-PCR 的敏感度为 2.510-6。图 1 PML/RAR 类型2.2 RT-PCR 阳性百分率 用全反式维甲酸治疗前 APL 患者 PML/RAR 的检测，34 例为 L 型阳性，5 例为 S 型阳性。L 型、S 型或 2 型的总阳性百分率分别为 80.9%（34/42）、11.9%（5/42）和 92.8%（39/42）。APL 患者 CR 后的MRD 阳性率是 56.7
8、%（21/37）。见表 1。表 1 APL 患者 RTPCR 检测阳性率的变化注：*2 cases with APL not getting CR2.3 APL 患者 MRD 的变化 缓解不同时期的 APL 患者 MRD 的变化（见图2）。结果显示：CR 后 MRD 百分率降低，57 年 MRD 百分率比缓解后低（ P0.05）。随访 3 或 5 年，MRD 阴性患者的无病生存率均明显高于 MRD 阳性患者（ P0.05），而 5 年时两组的存活率差异有显着性（ P0.05）。但在 3 和 5 年时，2 组间的无病生存率差异有显着性，MRD 阳性者低于其阴性者（ P0.05）。至于存活百分率方
9、面，3 年时 2 组之间无明显差别，5 年时差异明显。因此，此结果进一步说明RT-PCR 检测 MRD 能预告 APL 复发。与陈竺等15的报道结果一致。但是，后者比我们观察的时间短。总之，在 APL 缓解期经 ATRA 或巩固治疗后 MRD 阳性者有可能复发。据此我们建议 APL 患者 CR 后最好应用 RT-PCR 连续检测 MRD，当缓解期 MRD 阳性时，及时给予治疗（巩固化疗，ATRA 或亚砷酸治疗）。参考文献1 Baruchel A，Schaison G. Detection of minimal residual disease in leukemias. Nouv Rev Fr
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