《凝血酶蛋白的稀土特异性标记与绝对定量》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凝血酶蛋白的稀土特异性标记与绝对定量（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、凝血酶蛋白的稀土特异性标记与绝对定量摘 要：采用夹心法，用稀土离子标签标记凝血酶蛋白进行定量分析。通过选择合适的适配子，将 MMF-DOTA-La 标签接到适配子上,另选一种适配子接上包覆 BSA 的磁性纳米粒子。血清中，两种适配子特异性的选择结合到目标凝血酶蛋白上。磁性纳米粒子可以实现目标蛋白在磁场中快速分离,热解除去纳米粒子，将目标物质用 ICP-MS 检测 La 离子浓度。实验发现，稀土标签具有很高的灵敏度，离子检测强度和目标蛋白浓度具有很好的线性相关。关键词：稀土，凝血酶，适配子，夹心体1 背景介绍1.1 凝血酶蛋白作用及定量方法1.1.1 凝血酶凝血酶是一种多体络合酶，参与多种酶促反
2、应和细胞反应，可以促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白，起到凝固血液作用。局部应用后作用于病灶表面的血液很快形成稳定的凝血块，用于控制毛细血管、静脉出血，或作为皮肤、组织移植物的黏合、固定剂。凝血酶对血液凝固系统的其他作用尚包括诱发血小板聚集及继发释放反应等。临床上，个体血液中凝血酶的含量是一项重要的生理指标，反映个体的自我止血能力，可以在手术中为医生提供参考。但是从目前的医学条件来看，尚无可以直接从病人体中检测凝血酶即时浓度的方法。一般的，通过检测血液中 TAT （thrombin-antithrombin-complexes）的含量来间接的了解凝血酶的浓度，但是由于 TAT 的半衰期远远大于凝血酶
3、半衰期，这个浓度值远不能反映凝血酶实时浓度。传统凝血酶标记方法常见细胞抗原-抗体免疫实验，通过荧光探针检测法得到蛋白浓度，但这种方法操作复杂，而且存在光谱重叠，发色团不稳定，光漂白等问题。近年来出现以两种功能适配子结合凝血酶蛋白，然后分离，通过检测适配子中金纳米粒子浓度来分析凝血酶浓度的新方法。本实验提出一种以两种功能适配子为连接体，以稀土作为标签的检测凝血酶浓度的新方法。1.1.2 凝血酶的标记策略1.1.2.1 适配子适配子是 RNA 分子或单链 DNA 分子,可以选择性的结合到各种目标分子上,如:蛋白质,核酸,细胞,小分子有机物等。利用 SELEX 技术从体外人工合成的单链随机寡核苷酸文
4、库中经过多轮筛选和富集可获得能与靶分子高亲和力和高特异性结合的适配子。它的亲和力和特异性能与抗体媲美，甚至优于抗体，且具备抗体所不具备的一些优点，如核酸适配子的分子量小、制备简单、生产不依赖于动物、成本低、易重复、毒性低、无免疫源性等。1.1.2.2 ICP-MS 检测法作为一种准确和高灵敏度的元素检测仪器，ICP-MS 具有许多优异的特性，包括：大的浓度检测区间（9 个数量级） ，不同蛋白质之间独立的检测信号，多元素同时检测和很高的元素分辨率。近年来，ICP-Ms 开始用于蛋白质绝对定量，如应用最广泛的是对蛋白质中 S，P，Se 同位素的检测。然而由于些同位素自然丰度较低，导致离子化和多原子
5、光谱效应较差，在 ICP-MS 中检测效果有限。最近，通过接入 ICP-MS 灵敏度高的元素标签来实现蛋白绝对定量成为一种可选策略。1.1.2.3 凝血酶的绝对定量凝血酶标记反应是一个高度灵敏性和专一性反应，反应中使用两种新型适配子来增大反应的专一性：其中稀土标记的 Apt29 与凝血酶上的肝磷脂位点结合，由于稀土标签和目标蛋白以 1：1 关系结合，所以可以利用它对目标蛋白进行绝对定量。包覆在磁性纳米粒子上的 Apt15 与凝血酶上的纤维蛋白原位点结合，磁性纳米粒子在磁场中便于分离，用于捕获目标蛋白,而且可以增大反应的速率，每粒磁性粉大概可以结合 1400000 个 Apt15。将制备的夹心体
6、在磁场下分离,将分离物加热至 90，这时 Apt15 连接蛋白的键断开，apt15 脱离产物。在磁场作用下分离除去 Apt15-magnetic beads，剩余稀土标签产物利用 ICP-MS 检测。通过做出标准工作曲线，然后比较待测样 ICP-MS 强度值最终得到凝血酶蛋白浓度。1.2 本课题的实验思路以稀土元素标签的 ICP-MS 蛋白质检测法是近几年出现的一种新型检测策略，由于生物体中稀土元素含量极少，所以检测背景低，而且 ICP-MS 对稀土元素非常灵敏，可以实现多元素同时检测，稀土中包含 17 种元素，这使多蛋白同时标记成为可能。首先，选择合适的适配子，并合成出磁性纳米粒子和稀土标签
7、，对合成磁性纳米粒子条件进行了优化考察，包括反应温度、时间和溶剂量比对性能的影响，筛选出最佳反应条件，为后面的研究打下扎实的基础。其次，在上述实验基础上，尝试凝血酶夹心体反应。通过适配子对肝磷酯位点和纤维蛋白原位点的特异性识别，把两种适配子分别加入血样中培养一段时间，然后利用磁性纳米粒子特性，在磁场中分离目标蛋白。最后，重点研究了 ICP-MS 对稀土标签的检测。通过考察凝血酶浓度和稀土离子检测信号强度之间的线性关系,推测本检测手段的可行性实验中，对合成磁性纳米粒子的条件进行了一些探究，期望制备出具有均一大小，包覆二氧化硅、氨基和羧基良好的纳米粒子。2 实验部分2.1 实验原理凝血酶绝对定量M
8、odified Apt 29 制备Modified Apt15 制备Thrombin 绝对定量分子模型假设2.2 原料与试剂试剂和气体 纯度 来源 TEOS AR 阿拉丁试剂APTES AR 阿拉丁试剂FeCl-6H2O AR 国药集团化学试剂有限公司无水乙酸钠 AR 国药集团化学试剂有限公司乙二醇 AR 国药集团化学试剂有限公司DMF AR 国药集团化学试剂有限公司PEG(600) AR 阿拉丁试剂无水乙醇 AR 国药集团化学试剂有限公司Apt15 5-biotin-TEG linker-GGT TGG TGT GGT TGG-3 (TEG: tetra- ethylene glycol)
9、生物生工Apt29 5-HS-(CH2)6-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3 生物生工 MMA-DOTA Macrocyclics (Dallas, TX)La Cambridge Isotope LaboratoriesHNO3 GR 德国默克公司凝血酶蛋白 sigma 试剂 其他：buffer A (50 mM Tris-HCl 2 M NaCl 0.1% Tween 20, pH 7.4)buffer B (20 mM Tris-HCl 140 mM NaCl 5mM KCl 1 mM MgCl2 1 mM CaCl2, pH 7.4).2
10、.3 实验具体步骤2.3.1 Modified Apt 29 制备室温下把 La2O3 溶解在 HNO3 中，溶液放在电热炉上加热逐渐蒸干，产物在 2%稀 HNO3中稀释至最终浓度为 500mmol /L 的 La 溶液Apt29（25L，10nmol/L）加入 TECP（5 倍 Apt29 的量） ，然后在 37和 150L 缓冲液（尿素 8mol/L 和 NH4AC100mmol/L 混合液，PH6.8）反应 30min，随后加入 5 倍的量的MMA-DOTA，与-SH 反应。在 DOTA 与 La 螯合阶段，为了避免 La 和 MMA-DOTA 螯合时沉淀，反应时 PH 要控制在5.8，
11、用 500mmol/L NH4AC 作缓冲液。加入 5 倍 Apt29-MMA-DOTA 量的 La 溶液，在 37 下反应 1h，随后加入适量 EDTA 溶液除去过量的 La。梯度洗脱得到 La 标签。2.3.2 Modified Apt15 制备把 4 mg 链酶亲和素包覆的磁性纳米粒子（10mg/ml）加到 600ul 离心管中，用 400ul 缓冲液 A 冲洗一遍，然后加入 200ul 缓冲液 A 悬浮，接着加入生物酰化的 Apt15 19uM 和150 ul 的水在摇动下反应 2 h。用缓冲液 B 冲洗三次，在磁场分离器当中分离产物。最后产物重悬浮在 400ul 缓冲液 B 当中，在
12、 4下保存，备用。2.3.3 凝血酶夹心反应取 5 只微量试样瓶，各加入凝血酶样品和 43ul Apt29-modified，2ul Apt15-modified 混合均匀。混合物转移到 0.6-ml 离心管中，在摇晃条件下室温下反应 1 h。用磁场分离器提取产物，然后用 100ul 缓冲液 B 冲洗 3 遍，重新悬浮在 100ul 缓冲液 B 当中，然后加热到90并保持 20min，使 magnetic beads 与 夹心凝血酶分离，再次用磁场分离器分离magnetic beads，分离出的 beads 被舍弃，产物分析前用 1%HNO3+1%BSA 稀释 20 倍，在ICP-MS 当中检
13、测，每份试样要测 6 遍。3 结果和讨论3.1 评价凝血酶蛋白浓度和检测信号强度线性关系Thrombin（nM）评价凝血酶蛋白在标准浓度下（0.01-10nM ）发生酶夹心实验。当酶浓度在 0.05-1nM 变化时，检测的 ICP-MS 信号强度和浓度之间有较好的线性关系（R=0.997 ） ，说明以稀土离子标签的夹心反应定量凝血酶蛋白具有可行性。结论凝血酶是一种多体络合酶，参与多种酶促反应和细胞反应，可以促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白使血液凝固。临床上，个体血液中凝血酶的含量是一项重要的生理指标，反映个体的止血能力，可以在手术中为医生提供参考。本实验初步发展一种以稀土元素标签的 ICP-MS
14、凝血酶蛋白质检测策略，由于生物体中稀土元素含量极少，所以检测背景低，而且 ICP-MS 对稀土元素非常灵敏，可以实现多元素同时检测，这使多蛋白同时标记成为可能。结果显示，标记蛋白浓度和稀土标签检测信号之间具有良好的线性关系，说明该标记策略有可能成为一种有效的定量手段。蛋白质的稀土标签绝对定量将会成为未来重要的研究领域。参考文献1 Xiaowen Yan, Ming Xu, Limin Yang,and Qiuquan Wang* Absolute Quantification of Intact Proteins via1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7-trisacetic acid-10-Maleimidoethylacetamide -EuropiumLabeling and HPLC Coupled with Species-Unspecific Isotope Dilution ICPMS *Anal. Chem. 2010, 82, 126112692 Sonia Centi, Sara Tombelli, Maria Minunni, and Marco Mascini * Aptamer-Based Detection
