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1、药学论文-地红霉素肠溶颗粒在健康人体的生物利用度及药动学作者：张志华，周彦彬，丁劲松，田娟 【摘要】 目的：建立正常人血浆中红霉胺 HPLC-MS 测定法，研究地红霉素两种肠溶制剂的人体生物利用度和药动学。方法：以克拉霉素为内标，血浆样品碱化后用乙酸乙酯萃取，经 Thermo Hypersil-Hypurity C18 柱（150 mm2.1 mm，5 m）分离，以 MS 检测器检测。采用二周期随机交叉试验设计，将 18 名健康男性志愿者随机等分成两组，分别单剂量口服 0.5 g 地红霉素肠溶颗粒剂（试验制剂 T）或地红霉素肠溶片（参比制剂 R）。结果：红霉胺与内标分离度好，内源性杂质不干扰测
2、定。红霉胺浓度在 3.1736 g/L 范围内与峰面积比线性关系良好，最小可定量浓度为 3.1 g/L。回收率为97.0%99.1%（n=5），日内 RSD 为 4.0%9.9%（n=5）；日间 RSD 为4.4%11.2%（n=15）。 T 与 R 的 Tmax 分别为（2.60.7）h、（2.60.8）h；Cmax 分别为（339.4118.1）g/L 和（360.8139.5）g/L；AUC0144分别为（3 225.0986.5）gh/L 和（3 188.21057.9）gh/L；T1/2 分别为（44.73.5）h 和（42.65.9）h。与参比制剂相比，试验制剂的相对生物利用度为（
3、103.117.5）%。药动学参数经多因数方差分析显示周期间与制剂间差异均无统计学意义（P0.05），双单侧 t 检验表明接受 T 与 R 生物等效的假设，经计算 90%置信区间均在规定值内。结论：T 与 R 为生物等效制剂。 【关键词】 地红霉素；红霉胺；高效液相色谱-质谱法；相对生物利用度AbstractObjective: To establish an HPLC-MS method for determination of erythromycylamine in human plasma and to study the pharmacokinetics and the relati
4、ve bioavailability of two enteric dirithromycin preparations.Methods:With clarithromycin as its internal standard, the sample of blood plasm,after alkalized,were extracted by acetic ether,then separated on a Thermo Hypersil-Hypurity column (C18 150 mm2.1 mm,5 m),and detected by a MS detector.In a te
5、st of two periods of a random crossover study,an oral dose of 0.5 g dirithromycin enteric-granule (T) and its reference (R) were administrated to two groups of healthy volunteers with 9 in each. and then the pharmacokinetics and relative bioavailability were studied.Results: The calibration curve wa
6、s linear within the range 3.1 to 736 g/L, the recovery rate of erythromycylamine from plasma was in the range of 97.0%99.1% (n=5), inter-day and intra-day RSD were 4.0%9.9% (n=5) and 4.4%11.2% (n=15) respectively.The main pharmacokinetics of T and R were as following:AUC0144were (3,225.0986.5) gh/L
7、and (3,188.21,057.9)gh/L;Tmax were (2.60.7)h and (2.60.8)h;Cmax were (339.4118.1)g/L and (360.8139.5)g/L;T1/2were (44.73.5)h and (42.6 5.9)h.The result of ANOVA and two one-side t-test statistical analysis showed no significant differences among T and R (P0.05).The 90% confidence interval was in the
8、 regulated range.Conclusions:T and R are bioequivalent.Key wordsDirithromycin;Erythromycylamine;HPLC-MS;Relative bioavailability地红霉素（Dirithromycin）为大环内酯类抗生素，是红霉胺的前体药物，口服给药后很快转变成红霉胺而起作用，其抗菌谱和抗菌活性与红霉素相似。地红霉素在软组织中的药学特性较红霉素有所改善，消除半衰期长，且与其它由细胞色素 P450 系统代谢的药物相互作用少1。因此，常以测定红霉胺的血药浓度来研究地红霉素体内的药动学特征。本实验建立了 HP
9、LC-MS 法测定红霉胺的血药浓度，采用二周期随机交叉试验设计，比较了地红霉素肠溶颗粒与肠溶片在 18 名健康受试者体内的药动学及相对生物利用度，旨在评价试验制剂与参比制剂的生物等效性，为临床合理用药提供依据。1 材料与方法 1.1 仪器LC-MS2010 液相色谱-质谱联用仪，LC-10AD VP 低压四元梯度泵，CTO-10A VP 柱温箱，SCL-10AD VP 系统控制器，LC-MS solution 工作站（日本岛津）；DZF-6020 型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；TG16-W 微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；ER-182A 型电子天平（日本 AND 公司
10、）。1.2 试药地红霉素肠溶颗粒（0.25 g/包，海南皇隆制药厂有限公司，批号：050701）；地红霉素肠溶片（商品名：域大，0.25 g/片，湖南维康制药有限公司，批号：20031201）；红霉胺标准品（中国药品生物制品检定所）；克拉霉素标准品（内标，中国药品生物制品检定所，997 IU/mg），乙腈（色谱纯，Caledon Company）；乙酸乙酯（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；甲醇（色谱纯，浙江临海市浙东特种试剂厂）；其它试剂均为国产分析纯（AR 级）；所有试验用水均为重蒸馏水。1.3 受试者及试验设计受试者均为健康男性，年龄 2125 岁，体重 5272 kg，无烟酒嗜好，试验前
11、经询问病史、体格检查和实验室检查未发现异常。无药物过敏史和药物依赖史，无慢性病史，四周内未服用任何可能影响本品吸收、代谢的药物。受试期间统一清淡饮食，不使用除试验（参比）制剂以外的任何药物，不接受烟、酒及含咖啡的饮料，试验前签署知情同意书。采用二周期随机交叉自身对照试验，将 18 名受试者等分成二组。分别在二周期内口服地红霉素受试制剂和参比制剂 0.5 g，服药前及服药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0、48.0、72.0、96.0、120.0、144.0 h 分别取血 5 mL。洗脱期为 14 d，交叉给药后取血方法和时间相同。取血后离心分取
12、血浆，-20 保存。血浆样品用新建立的 HPLC-MS 方法测定。1.4 血样测定1.4.1 标准溶液配制 红霉胺溶液：精确称取红霉胺 18.4 mg 于 100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度（184 g/mL）。置于 4 冰箱中保存，使用时用流动相稀释至所需浓度。内标溶液：称取克拉霉素 12.5 mg 于 100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，应用时进一步稀释为 12.5 g/mL，置于 4 冰箱中保存备用。1.4.2 色谱条件及质谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil-Hypurity C18（150 mm2.1 mm，5 m）；柱温：45 ；流动相：10 mmol
13、/L 醋酸铵（pH 6.4）-甲醇-乙腈=50 10 30；流速：0.2 mL/min。质谱条件：电喷雾电离源（ESI），选择性正离子监测（SIM），监测质荷比（M/Z）368（红霉胺，M+2H）和 237（克拉霉素，M+H）带正电荷的分子离子峰，电离源电压 4.5 kV，喷雾气氮气（N2），流速 1.5 L/min，脱溶剂温度 250 ，检测器电压 1.5 kV。1.4.3 血浆样品预处理 取待测血浆 0.2 mL 于 2 mL 离心管中，加入内标溶液（12.5 g/L）50 L， 加饱和碳酸钠溶液 0.1 mL，混匀，加乙酸乙酯 1 mL，振荡 2 min，14 000 r/min 离心
14、5 min，将有机相转移至另一管中，45 真空干燥箱中抽干，残渣用流动相 100 L 溶解，取上清液 5 L 进样。1.5 参数的计算与数据处理从药时曲线获得两种制剂的主要药动学参数，Cmax 及 Tmax 采用实测值，AUC0144 以梯形面积法计算，以消除后相血药浓度对数值和时间回归计算消除速率常数 K 和半衰期 T1/2。AUC0=AUC0t+Ct/K，以试验制剂 AUC0t和参比制剂 AUC0t 的比值计算生物利用度（F）、AUC0t 和 Cmax，经对数转换后进行药物间、周期间、个体间的三因素方差分析，再以双单侧 t 检验进行等效性判断。若受试制剂 AUC0t 的 90%可信限落在参
15、比制剂 80%125%范围内，Cmax 的 90%可信限落在 70%143%范围内，则认定受试制剂与参比制剂生物等效。Tmax 采用原值进行非参数检验。2 结果 2.1 色谱行为红霉胺的保留时间约为 5.4 min，内标的保留时间约为 3.2 min，基线平稳，血浆内源性物质及其它杂质不干扰样品的分离测定。红霉胺和克拉霉素标准液、空白血样、空白血样中加入标准品及受试者服药后 3 h 血浆的总离子流图见图 1。2.2 线性关系用空白血浆将红霉胺标准贮备液稀释成浓度分别为 3.1、9.2、18.4、36.8、73.6、147.2、368.0、736.0 g/L 的系列浓度溶液，漩涡振荡 2 min
16、，混匀，余照“血浆样品预处理”项下操作，记录红霉胺及内标的峰面积。以红霉胺和内标峰面积比（A/AIS）与红霉胺浓度（C）进行线性回归，得回归方程为：A/AIS0.0139C-0.0052，r2=0.9981，红霉胺浓度在3.1736.0 g/L 范围内与峰面积比线性关系良好，最小可定量浓度为 3.1 g/L。2.3 回收率及精密度配制含红霉胺浓度分别为 3.1、73.6、736.0 g/L 的血浆样品各 5 份，按“血浆样品预处理”项下操作，记录红霉胺和内标峰面积，按回归方程计算测得浓度，以测得值与加入值的比值计算回收率，并计算日内精密度，高、中、低浓度回收率为（99.14.0）%、（97.03.7）%、（98.79.9）%（n=5），日内 RSD 为 4.0%10.0%（n=5）。对上述样品连续测定 3 d，考察日间
