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1、医学论文-应用 DNA 微阵列技术研究三氧化二砷对 RPMI 8226 细胞的作用作者：王梦昌，刘陕西，刘蓬勃 【关键词】 三氧化二砷摘要 目的：应用 cDNA 芯片技术研究三氧化二砷对多发性骨髓瘤细胞株 RPMI 8226 的作用。方法：采用包含 4 096 个人类基因的 cDNA 表达谱芯片，检测三氧化二砷作用于 RPMI 8226 细胞 24 h 前后其基因表达的变化。结果：在mRNA 水平上，273 个基因的表达发生了明显改变，其中 121 个基因表达上调，152 个基因表达下调。结论：三氧化二砷可引起 RPMI 8226 细胞株一系列基因表达的改变。ZFYVE16、TXNIP 及 A
2、LK1 基因可能与 RPMI 8226 细胞的分化与凋亡密切相关。关键词 三氧化二砷; DNA 微阵列; 多发性骨髓瘤Changes of gene expression profile of multiple myeloma cell line RPMI 8226 treated by arsenic trioxideABSTRACT Objective: To compare the changes of gene expression profiles of multiple myeloma cell line RPMI 8226 before and after 24hour inte
3、rvention of arsenic trioxide. Methods: The responses of the RPMI 8226 cells to arsenic trioxide were determined with cDNA microarray which included 4 096 different human genes. Results: Of these 4 096 genes, the expressions of 273 genes were altered significantly at mRNA level. The expressions of 12
4、1 genes were upregulated while the expressions of 152 genes were downregulated. Conclusion: The effect of arsenic trioxide on RPMI 8226 cells is related to changing the expression levels of a number of genes. ZFYVE16, ALK1 and TXNIP genes may play important roles in apoptosis and differentiation of
5、RPMI 8226 cells.KEY WORDS arsenic trioxide; DNA microarray; multiple myeloma多发性骨髓瘤（multiple myeloma, MM）是一种浆细胞恶性增殖性疾病。由于 MM 瘤细胞的增殖比例很低及多药耐药的形成，目前临床治疗该病仍十分困难，迄今为止尚无根治的方法。最近的临床资料显示，三氧化二砷对 MM 有一定的治疗效果，且无严重的毒副作用1,2。为探寻三氧化二砷治疗 MM 的作用机制，本实验应用 DNA 微阵列技术研究三氧化二砷作用于 MM 细胞株后对其基因网络的调控作用。1 材料与方法1.1 材料 （1）三氧化二砷，购
6、自中国药品公司，样品溶于 RPMI 1640培养基（美国 Gibco 公司产品），灭菌分装备用，存储浓度为 35 mg/L，使用时稀释为工作浓度 2 mol/L。（2）RPMI 8226 细胞，为人类 MM 细胞株，由西安交通大学第一医院血液中心提供。1.2 细胞培养 取 RPMI 8226 细胞按 1105/ml 浓度分别接种于含及不含2 mol/L 三氧化二砷的新鲜 RPMI 1640 培养基中（内含 10%小牛血清、1 mmol/L 谷氨酰胺、1 mmol/L 丙酮酸、100 U/ml 青霉素、100 U/ml 链霉素），于 37 、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后收集细胞。1.
7、3 总 RNA 的提取 按照 TRIzol Reagent（美国 Gibco 公司产品）说明书进行操作，提取 RPMI 8226 细胞总 RNA，采用 Oligotex mRNA Midi Kit（荷兰 QIAGEN 公司产品）纯化 mRNA，应用 RNA 电泳及分光光度仪测定光密度（optic density, OD）值，计算 OD260/OD280 值以鉴定 mRNA 质量。1.4 探针标记 按美国 Biostar 公司芯片杂交试剂盒说明书操作。分别等量混合未使用三氧化二砷干预的 RPMI 8226 细胞总 RNA 及已使用三氧化二砷干预 24 h 后的 RPMI 8226 细胞总 RNA
8、，各提取 50 g 逆转录合成 cDNA。采用荧光染料 Cy3dCTP 标记未使用三氧化二砷干预的 RPMI 8226 细胞 cDNA，Cy5dCTP标记已使用三氧化二砷干预 24 h 后的 RPMI 8226 细胞 cDNA，S200 纯化柱纯化cDNA。1.5 DNA 微阵列制备 DNA 微阵列包含 4 096 个基因 cDNA（上海博星基因芯片有限公司提供，型号 BiostarH40s），包括癌基因、抑癌基因、细胞信号转导基因、凋亡相关基因及阴性对照等。采用通用引物进行多聚酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增。使用美国 Cartesian 公司的C
9、artesian 点样仪及美国 Telechem 公司的硅烷化玻片进行点样。玻片经水合、干燥、紫外线交联后，分别采用 2 g/L 十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate, SDS）、水和 2 g/L 硼氢化钠溶液处理 10 min，晾干备用。1.6 杂交及洗涤 DNA 微阵列在 95 水浴中变性 2 min，混合探针在 95 水浴中变性 30 s，将混合探针加于 DNA 微阵列上，42杂交 1618 h，按顺序使用 2氯化钠/柠檬酸钠（sodium chloride / sodium citrate, SSC）缓冲液加 2 g/L SDS、0.1SSC 加 2 g/L SD
10、S、0.1SSC 洗涤 10 min 后，室温晾干。1.7 MM 基因表达谱检测与分析 采用 Scan Array 4000 扫描仪（美国General Scanning 公司产品）扫描 DNA 微阵列，GenePix Pro 3.0 软件分析Cy3 和 Cy5 这两种荧光信号的强度和比值。经两种波长扫描获得的强度值分别代表 Cy3 和 Cy5 的数值，计算每个点 Cy3/Cy5 的比值。2 结果2.1 DNA 微阵列的质量标准控制 BiostarH40s 表达谱 DNA 微阵列的质量标准：有 96 个管家基因（阳性对照）和 20 个内参基因必须为阳性，16 个植物基因（阴性对照）和 16 个
11、点样液（空白对照）必须为阴性。本实验结果完全符合上述条件，说明实验无污染且检测体系正常。2.2 差异表达基因 先将所有数据的前景值与背景值相减，得出Cy3、Cy5 标记的强度值，将所有200 的强度值用 200 取代。根据总数为 n 的有效基因（select 值1，Cy3、Cy5 标记的强度值皆200，或者其中 1 项800）Cy5/Cy3 比值的自然对数值InRiIn（Cy5/Cy3），以 Ri 值在0.110 的有效基因作为均一化依据，计算这些基因 Cy5/Cy3 比值自然对数的平均值，即均一化（normalization）系数。将所有数据项的 Cy3 标记强度值乘均一化系数，得出调整后的
12、 Cy3。计算所有基因 Cy5/Cy3 的比值，列出比值2或0.5 的数据，从中筛选出具有相同 Gene ID 的数据，在与两种探针杂交时皆表现出一定的差异，且上下调趋势一致。根据以上筛选标准，RPMI 8226 细胞在三氧化二砷处理前后 Cy5/Cy3 的比值2 或0.5，且同一基因两个重复点表达均有相同变化的共有 273 个，其中表达上调的基因有 121 个，表达下调的基因有 152 个。见表 1、2，图 1、2。表 1 三氧化二砷干预后 RPMI 8226 表达上调基因（略）Table 1 Upregulated genes in RPMI 8226 cell samples after
13、 arsenic trioxide intervention表 2 三氧化二砷干预后 RPMI 8226 表达下调基因（略）Table 2 Downregulated genes in RPMI 8226 cell samples after arsenic trioxide intervention图 1 Cy5、Cy3 荧光标记三氧化二砷干预和未干预 RPMI 8226 细胞样品叠加图（略）Figure 1 Superposition maps of Cy5 and Cy3labeled RPMI 8226 cell samples treated with and without ars
14、enic trioxide On one spot, if Cy3 signal was much stronger than Cy5 signal, it showed green (i.e. downregulation); if Cy5 signal was much stronger than Cy3 signal, it showed red (i.e. upregulation); if the intensities of Cy3 and Cy5 signals were similar, it showed yellow.图 2 三氧化二砷干预与未干预 RPMI 8226 细胞
15、样品 Cy5/Cy3 比值散点图（略）Figure 2 Scatter diagram of Cy5/Cy3 ratios in RPMI 8226 cell samples treated with and without arsenic trioxideXaxis and Yaxis represented the fluorescence intensities of Cy3 and Cy5 respectively. Each point in the scatter diagram represented the hybridization signal of correspondi
16、ng gene in DNA microarray. The red point meant that the Cy5/Cy3 ratio was within the range of 0.5 to 2.0 (with no significant difference in gene expression). The yellow point meant that the Cy5/Cy3 ratio was beyond the range of 0.5 to 2.0 (with significant difference in gene expression).3 讨论本研究应用 cDNA 表达谱芯片技术检测三氧化二砷未干预及干预 24 h 后RPMI 8226 细胞的基因表达差异，探寻三氧化二砷治疗 MM 的机制。实验结果显示，在 4 096 个已知基因中差异表达基因 273 个，其中上调基因 121
