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1、医学论文-尾加压素促进肾系膜细胞增殖的细胞内机制研究【摘要】 目的：研究尾加压素(U)对肾系膜细胞(GMC)增殖功能的影响以及细胞内信号转导机制。方法：采用3H_胸腺嘧啶(3H_TdR)掺入实验研究U对 GMC 增殖的影响。加入不同的细胞内信号转导阻断剂，观察 U作用的信号转导通路。结果：U以浓度(10-910-7)mol/L依赖的方式促进 GMC3H_TdR 掺入，分别较对照组高 86.9%、105.8%和 134.2%(P0.05)。结论：U明显促进 GMC 增殖，该效应与胞外 Ca2+内流、CaM_PK 以及 PKC 有关，并提示 U可能在肾纤维化发生和发展过程中发挥着重要作用。 【关键
2、词】 肾系膜细胞 增殖 尾加压素 信号转导Mechanisms of Proliferation Effect of Urotensin on Glomerular Mesangial Cells of RatsZHANG Yong_gang，WEI Rui_hong，LI Yu_guang，PANG Yong_zheng，TANG Chao_shu(Department of Cardiovascular Diseases, The First Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou 515041, C
3、hina；Department of internal medicine, The Second Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China；Institute of Cardiovascular Research, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China)AbstractObjective: To investigate the proliferation effect of urotensin (U)on
4、glomerular mesangial cells (GMC)of rats，and to study the signal transduction pathways. Methods: GMC proliferation was examined by the increase in 3H_thymidine(3H_TdR)incorporation into DNA. Different inhibitors were used to study the signal transduction pathways involved in the effect of U. Results:
5、 U(10-910-7)mol/Linduced 3H_TdR incorporation in a concentration_dependent manner, which was increased by 86.9%, 105.8% and 134.2%(P99.5%)为 Phoenix Pharm Inc 产品(美国)。RPMI 1640 培养基、钙通道阻断剂尼卡地平(NI)、蛋白激酶 C(PKC)抑制剂 H7、钙调素激酶阻断剂 W7 以及丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)阻滞剂 PD98059 为 Sigma 公司(美国)产品，3H_胸腺嘧啶(3H_TdR)为 AmershamPharm
6、aciaBiotech 公司(德国)产品，余为市售分析纯试剂。1.2 方法1.2.1 大鼠肾小球分离和 GMC 培养 见参考文献16。1.2.2 3H_TdR 掺入实验13 将培养的细胞用 1.25g/L 胰酶消化并制成细胞悬液，以 2104/孔接种于 24 孔板，贴壁培养 24h 后，换为乏血清培养(体积分数 1%血清)24h，使细胞处于 G0 期，加入不同浓度的 U培养 12h，然后加入 3H_TdR(37kBq/孔)继续培养 12h，用 Millipore 抽滤，收集于玻璃纤维膜上，用体积分数 10%高氯酸破碎细胞，PBS 冲洗，滤膜干燥后加入闪烁剂(PPO/POPOP/二甲苯/无水乙醇
7、)，用液闪仪(Beckman 公司，德国)检测 3H 放射性强度，结果以 cpm 表示。1.2.3 实验分组 以不同浓度 U对 GMC 3H_TdR 掺入的影响分为对照组，U_1 组(10-10mol/L)，U_2 组(10-9mol/L),U_3 组(10-8mol/L),U_4 组(10-7mol/L)。以不同信号途径阻断剂对 U效应的影响分为对照组(不加任何处理因素)，U组(只加 U，浓度 10-8mol/L，下同)，U+NI(10-5mol/L)组，U+H7(10-6mol/L)组，U+W7(10-6mol/L)组，U+PD98059(10-5mol/L)组。1.2.4 统计学处理 数
8、据以s 表示，用方差分析组间 q 检验。2 结果2.1 U对 GMC 3H_TdR 掺入的影响U以浓度(10-910-7)mol/L依赖性方式促进 GMC 3H_TdR 掺入，以U_4 组刺激作用尤为明显。U 24 组 3H_TdR 掺入量分别较对照组高86.9%，105.8%和 134.2%(P0.05，表 1)。表 1 U对 GMC 3H_TdR 掺入的影响（略）Table 1 Effect of U on 3H_TdR incorporation into GMC of rats与对照组比 1)P0.05，表 2)。表 2 细胞内信号转导阻断剂对 U刺激 GMC 3H_TdR 掺入的影响
9、（略）Table 2 Effects of different signal transduction inhibitors on proli_feration of rats GMC induced by U与对照组比 1)P0.01；与 U组比 2)P0.013 讨论U是继 ET_1 之后发现的又一新的缩血管活性肽，它能够收缩哺乳动物的大中动脉血管、气道和肠道平滑肌，收缩离体心肌组织，并有促丝裂作用，能刺激血管内皮细胞、平滑肌细胞、气道平滑肌细胞以及肿瘤细胞增殖，诱导心肌细胞肥大9。我们曾在离体孵育的大鼠主动脉组织上发现，U能以剂量依赖性方式激活 NO 合酶，尤其是血管固有型 NO 合酶，
10、增加血管 NO 生成，促进血管外膜精氨酸转运17,18。我们曾报道慢性缺氧致肺动脉高压大鼠心肌U含量以及 U受体结合位点明显升高19，最近发现 U能够协同异丙肾上腺素所致心肌肥大和心肌纤维化过程20。有学者报道肾功能衰竭患者和糖尿病肾功能衰竭患者 U表达明显升高21，提示 U可能在肾脏功能稳态调节以及疾病发生中发挥重要作用，然而其作用机制尚不完全清楚。本研究在体外培养的 GMC 上，采用 3H_TdR 掺入法，发现 U能够以浓度依赖的方式促进细胞 3H_TdR 掺入增加，促进细胞增殖。该作用能够分别被 Ca2+通道阻断剂 NI、钙调素激酶阻断剂 W7 以及 PKC 抑制剂 H7 所阻断，提示凡
11、影响胞浆 Ca2+水平上的信号转导途径，即 L_钙通道、CaM_PK 以及 PKC 都能够影响对 GMC 的促增殖效应。然而，PD98059 不影响 U的效应，提示受体酪氨酸激酶_MAPK 细胞增殖途径可能不是 U促 GMC 增殖的主要途径。U的病理、生理意义及其作用机制是近年的研究热点之一。我们在国内首先报道了 U的促丝裂效应。在培养的血管平滑肌细胞上，发现 U能够促进细胞增殖，该作用需通过 Ca2+、PKC、CaM_PK 以及 MAPK 来实现13。我们还发现 U能够促进新生乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原分泌，其增殖效应与细胞外 Ca2+内流、CaM_PK以及 PKC 激活有关，而促胶原合成
12、作用可能通过其它途径来实现22。在慢性缺血所致肺动脉高压右心肥大大鼠上，我们发现右心室 U以及受体结合位点明显上调，而血浆 U水平并无明显变化，提出 U可能主要以自分泌和旁分泌作用方式发挥效应这一观点19。上述结果进一步被其它学者所证实4,9。最近我们还发现 U能够通过 Ca2+、PKC 以及 MAPK 途径刺激大鼠主动脉组织合成和释放内皮素_123。一系列研究表明，U可通过 GPR14 受体、Ca2+、c_Src、PKC、MAPK 和 ROCK 途径参与平滑肌细胞增殖以及促进巨噬细胞向泡沫细胞转化9，并且 MAPK 途径激活还参与了 U促进内皮细胞增殖的过程14。而本研究则证实 U还能够通过
13、激活 L_钙通道、钙调素以及 PKC途径刺激 GMC 的增殖。这与 U促进心肌成纤维细胞的作用机制相近，但仍有待于进一步研究。GMC 是肾小球固有细胞，正常情况下 GMC 生长和分裂速度都很慢。但在病理情况下，生长和抑制失衡，GMC 增殖活跃，产生大量细胞外基质，最终导致肾小球硬化和肾纤维化、肾功能进行性下降。许多因素能够促进 GMC 活化，使之发生表型转化并异常增殖，分泌细胞外基质和活性因子、炎性介质等，促使病变的发生和发展。本研究发现 U能够促进 GMC 增殖，提示 U可能在肾小球炎症与硬化等疾病的发病过程中发挥重要作用。 【参考文献】1Coulouarn Y, Lihrmann I, J
14、egou S, et al. Cloning of the cDNA encoding the urotensin precursor in frog and human reveals intense expression of the urotensin gene in motoneurons of the spinal cordJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95 (26):15 803-15 808.2Ames RS, Sarau HM, Chambers JK, et al. Human urotensin_ is a potent vasocons
15、trictor and agonist for the orphan receptor GPR14J. Nature, 1999, 401(6 750): 282-286.3Spinazzi R, Albertin G, Nico B, et al. Urotensin_ and its receptor(UT_R)are expressed in rat brain endothelial cells, and urotensin_ via UT_R stimulates angiogenesis in vivo and in vitroJ. Int J Mol Med, 2006(6): 1 107-1 112.4Watanabe T, Suguro T, Kanome T, et al. Human urotensin accelerates foam cell formation in human monocyte_derived macrophagesJ. Hypertension, 2005, 46(4): 738-744.5Song W, Abdel_Razik AE, Lu W, et al. Urotensin and renal function in the ratJ. Kidney Int, 2006, 69(8):1 360-1 368.
