《模拟微重力环境下层状修复体与软骨细胞复合培养的实验研究【临床医学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《模拟微重力环境下层状修复体与软骨细胞复合培养的实验研究【临床医学论文】（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、临床医学论文-模拟微重力环境下层状修复体与软骨细胞复合培养的实验研究作者：张世浩，朱立新，靳安民，严乐平，王九现，黄锐，朱书涛 【摘要】 目的探讨模拟微重力作为软骨组织工程培养方法的作用和胶原/壳聚糖/-磷酸三钙（trical cium phosphate，TCP）层状梯度修复体作为关节软骨组织工程支架的可行性。方法体外培养新西兰大白兔关节软骨细胞并扩增,吸附于多孔胶原/壳聚糖/-磷酸三钙层状梯度修复体上，模拟微重力和普通环境下三维立体分别培养 3 周,通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测微重力对软骨细胞培养的影响和支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影
2、响。结果软骨细胞/修复体体外培养 3 周,软骨细胞模拟微重力培养组明显比普通培养组在层状修复体上分布均匀，修复体中心软骨细胞数量明显较多，并分泌细胞基质，包裹在软骨细胞周围，型胶原免疫组织化学染色阳性。结论模拟微重力环境有利于软骨细胞在三维支架上的均匀增殖，有望成为软骨组织工程中的一种重要培养方法；胶原/壳聚糖/-磷酸三钙层状梯度修复体，细胞兼容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料。 【关键词】 微重力; 层状修复体; 软骨细胞; 组织工程Abstract：ObjectiveTo evaluate the feasibility of the minic microgravi
3、ty as a method and the layered cylindric collagenchitosan tricalcium phosphate composite as a scaffold for the cartilage tissue engineering after an observation of how it absorbs the chondrocytes and affects the cell behavior.MethodThe chondrocytes were isolated and multiplied in vitro,and then the
4、chondrocytes were seeded onto the porous collagenchitosan tricalcium phosphate composite scaffold and were cultured in both minic microgravity and ordinary environment for 3 weeks.The effects of the composite scaffold on the cell adhesivity,proliferation,morphological changes and synthesis of the ex
5、tracellularmatrix were observed by the growth curve,phasecontrast microscopy,histology,scanning electron microscopy and immunohistochemistry.ResultThe chondrocytes that adhered to the scaffold increased significantly and secreted extracellular matrix in the center of the porous scaffold around the c
6、hondrocytes under minic microgravity compared with ordinary environment.Immunohistochemistry of type collagen was positive.ConclusionThe minic microgravity environment will be a good method for the cartilage tissue engineering.And the layered cylindric collagenchitosan tricalcium phosphate composite
7、 scaffold has a good cellular compatibility.It will be an ideal scaffold for the cartilage tissue engineering.Key words：microgravity； layered composite； chondrocyte； tissue engineering关节软骨损伤一直是骨科面临的难题之一。关节软骨本身缺乏营养血管，再生细胞和体液因子少，软骨的细胞/基质比低，一旦关节软骨损伤，其再生能力十分有限。此外，再生软骨的生物化学和机械性能不等同于正常软骨，容易退变和侵蚀。组织工程修复软骨手
8、段的目的是将修复物质运送到受损部位并且固定于该位置以达到有效的修复 。从研究结果来看，虽然研究者们应用了多种方法研究生物材料、种子细胞和修复，但修复关节软骨的长期效果并不令人满意，存在着组织工程软骨中心强度低、难以和宿主正常软骨整合、软骨和软骨下骨的断裂分层问题等难题13。作者希望通过最近新兴的模拟微重力技术，将软骨组织工程中应用广泛的胶原、壳聚糖与 TCP 有机复合,模仿体内关节软骨的分层结构,增加支架材料的力学强度，构建层状梯度复合材料，并将扩增的兔关节软骨细胞植入其中人工培养,观察软骨细胞在胶原/壳聚糖/-磷酸三钙层状梯度修复体中的黏附、增殖、生长情况及生物学性状变化,以评价微重力培养方
9、法在软骨组织工程的实用性及该复合材料作为关节软骨组织工程支架的可行性。1 材料和方法 1.1 主要试剂和仪器 DMEM/F12 、DHank s 、胰蛋白酶、EDTA (Sigma 公司，美国)；型胶原酶(Gibco 公司，美国)；胎牛血清（杭州四季青公司）；四氮唑蓝（上海思吉生物制品有限公司，中国）、型胶原抗体、S-100 抗体、SABC 试剂盒（武汉博士德公司）；12、24 孔培养板（CorningCostar 公司，美国）；旋转培养仪（Synthecon 公司，美国）；离心机（Sigma 公司，美国）；酶标测定仪（Metertech 公司，台湾）；CO2 培养箱（Heraers Hera
10、 cell，德国）；倒置显微镜（Olympus 公司，日本）；胶原/壳聚糖/ 磷酸三钙层状梯度修复体由华南理工大学材料学院制作提供，直径 5 mm，高 5 mm 圆柱形，上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/-磷酸三钙为主,两层之间逐渐过度，没有明显界限，平均孔径为 100 m,孔隙率90%。1.2 兔关节软骨细胞体外分离培养1.2.1 软骨采集 3 周龄新西兰大白兔 1 只,体重 0.5 g (南方医科大学实验动物中心提供,许可证号：SCXK(粤)2006-0015) ,10水合氯醛静脉注射麻醉,无菌条件下削取双侧股骨髁、胫骨平台、股骨头及肱骨头的关节软骨,切取厚度12 mm,不超过软
11、骨下骨板,软骨片切成 5 mm5 mm 大小,将切取的软骨片置于 DHank s 中(含青、链霉素各 100 U/ml)。1.2.2 软骨细胞悬液的制备 在超净台内用 DHank s 冲洗取下的软骨片 3 遍,修剪至 1 mm3 大小,移入离心管内,加入 5 倍量的 0.25%胰蛋白酶于 37振荡下消化 30 min,移出胰蛋白酶液,DHank s 冲洗 2 次。加入 0.2% 型胶原酶 8 ml ,37下消化 4 h。将消化的细胞悬液经 200 目金属滤网滤过并移至离心管内,加入 DHank s 离心(1 000 r/min,10 min),弃上清液,加入 5 ml DMEM/F12 培养液
12、,充分吹打成细胞悬液。细胞计数板计数,台盼蓝拒染检测分离软骨细胞活性。 1.2.3 软骨细胞单层培养 将细胞按 4105/瓶接种于培养瓶,加入 4 ml DMEM/ F12 完全培养基(含 10%胎牛血清,青霉素 100 U/ ml ,链霉素 100 U/ ml) ，置于 5 % CO2 ,37 恒温箱内培养,隔日换液,倒置显微镜下观察软骨细胞的生长情况,当软骨细胞融合成片时进行传代。培养的第 2、3 代细胞行 S100 免疫细胞化学染色。1.3 修复体预处理胶原/壳聚糖/-磷酸三钙层状梯度修复体经环氧乙烷消毒备用，实验前取12 个置于 12 孔培养板,DHank s 洗 3 遍,每次 20
13、min,再用 DMEM/F12 液浸泡过夜。1.4 细胞和支架复合普通培养选择生长状态良好的第 2、3 代细胞消化离心,用含 10% 胎牛血清的DMEM/F12 液配制成软骨细胞浓度为 1107/ml,滴入经 DMEM/F12 液预湿的复合支架中,每个支架加入 300 l，将培养板放入 5%CO2 浓度、饱和湿度、37培养箱内 30 min，然后每孔加入 1.0 ml DMEM/F12 完全培养基继续培养。隔日换液,培养 3 周， 进行相关检测。1.5 细胞和支架复合模拟微重力培养选择生长状态良好的第 2、3 代软骨细胞消化离心,用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 液配制成软骨细胞浓度
14、为 1107/ml,滴入经 DMEM/F12 液预湿的复合支架中,每个支架加入 300 l，置于孵箱中 30 min 后将细胞支架复合物放入微重力旋转培养仪中，加满 DMEM/F12 完全培养基，置于 5%CO2 浓度、饱和湿度、37培养箱内继续培养。隔日换液 1/3,培养 3 周,进行相关检测。1.5 检测指标1.5.1 倒置显微镜观察 对单层培养的软骨细胞及其修复体/软骨细胞每2 d 行倒置显微镜观察。 1.5.2 免疫学检测 取原代 80%融合的软骨细胞玻片，进行型胶原免疫组化化学染色。1.5.3 生长曲线 软骨细胞接种到材料上后用 MTT 比色法检测生长曲线，对照组为没有接种细胞的修复
15、体。方法为两组分别 6 例/次，隔日 1 组，共 9 次。以时间为横坐标，每组 6 孔吸光度的平均值为纵坐标，绘制生长曲线。1.5.4 扫描电镜观察 细胞接种后 3 周,两组分别取出 8 例修复体/软骨细胞复合物,2.5%戊二醛固定,系列脱水,乙酸异丙酯置换,临界点干燥,表面喷金后扫描电镜下观察。1.5.5 组织学和免疫组织化学检测 细胞接种培养 3 周后,两组分别取 8个修复体/软骨细胞复合物,以 4%中性福尔马林固定,系列脱水,石蜡包埋、切片,行HE 染色及型胶原免疫组织化学染色,光镜下观察。2 结 果2.1 软骨细胞形态体外单层培养的软骨细胞刚接种时呈球形,悬浮在培养液中,24 h 后开
16、始贴壁,细胞呈扁平状,大多数为三角形，少量多角形,48 h 后可见细胞分裂相,约 1周后细胞铺满培养瓶瓶壁,折光度降低,呈“铺路石”样（图 1）,可进行传代。第 2、3 代细胞 S100 免疫细胞化学染色胞浆内呈阳性反应（图 2）。2.2 生长曲线软骨细胞和材料复合后，除第 1 d 两组之间无显着性差异外（P=0.857），其余 6 个时间点两组之间有显着性差异（P=0.007,0.002,0.001,0.000,0.000,0.000），微重力组均比培养板组增殖力高。证明模拟微重力比普通培养更好地促进了细胞的增殖（表 1，图 3）。 2.3 扫描电镜 培养 3 周后,普通培养组软骨细胞成团地吸附于支架表面,从切开的材料上可以观察到有部分细胞吸附于空隙内，
