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1、引物设计基本原则引物长度（primer length）产物长度（product length）序列 Tm 值 （melting temperature）G+C 含量（composition ）引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）阅读框1. 引物的长度一般为 15-30bp,常用的是 18-27bp,但不能大于 38,因为过长会导致其延伸温度大于 74，即 Taq 酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为 100600 碱基对。3. Tm 值引物的 Tm 值一般控制在 55-60 度， 尽可能保证上下游引物的 Tm 值一致，一般不超过 2 度。 如果
2、引物中的 G+C 含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。Tm=2（A+T ） +4（C+G）4. 引物的 GC 含量有效引物中（G+C ）的比例为 40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。5. 引物自身引物间 3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败任务用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白 NR1引物要求PCR 扩增 GFPGFP 两边添加 BamHI 酶切位点保证 NR1 的阅读框不改变第一步：扩增 GFP 基本序列第二步：GC 比值；Tm 值第三步：酶切位点第四步：阅读框第五步 保护序列Primer1: 5 GCGGg
3、gatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的 PCR 条件摸索的讨论。后来 PCR 成为实验最基本的一步了，但是发现在 PCR 中还是有许多需要注意的地方。PCR 的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行 PCR 扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行
4、。设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： 引物长度一般引物长度为 1830 碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm 值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。在引物长度小于 20bp 时：4(G+C)+2(A+T)-5在引物长度大于 20bp 时：62.3+0.41(%G-C)-500/length-5另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化 PCR 反应，使用确保退火温
5、度不低于 54的最短的引物可获得最好的效率和特异性。总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高 4 倍，这样，大多数应用的最短引物长度为 18 个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶 DNA 上形成供 DNA 聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。 GC 含量一般引物序列中 G+C 含量一般为 40%60%，一对引物的 GC 含量和 Tm 值应该协调。若是引物存在严重的 GC 倾向或 AT 倾向则可以在引物 5端加适量的 A、T 或 G、C 尾巴。 退火温度退火温度需要比解链温度低 5，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使 P
6、CR 的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是 DNA 双链结合。一对引物的退火温度相差 46不会影响 PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在 5575间变化。 避免扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（G ）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。 与靶 DNA 的错配当被扩增的靶 DNA 序列较大的时候，一个引物就有可能
7、与靶 DNA 的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用 BLAST 软件进行检测，网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。选择 Align two sequences (bl2seq)，如下图。 BLAST 的使用方法也十分简单，如下图所示。将引物序列粘贴到 1 区，将靶 DNA 序列粘贴到 2 区，这两者可以互换的，并且 BLAST 会计算互补、反义链等多种可能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的 GI 号也可以直接输入 GI 号，这样就不用粘贴一大段的序列了。最后在 3 处点击 Align 就可以查看引物
8、在靶 DNA 中是否有多个同源位点了。可是使用 BLAST 还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需要分开进行比对。如果存在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶 DNA 和引物输入对产物片段进行预测。 引物末端引物 3端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3 端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在G+C 富集序列区错误引发。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的 PCR（AS-PCR ）反应中，引物 3端不能发生错配。如扩增编码区域，引物 3端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第
9、 3 位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 引物的二级结构引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于 3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免 3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性。 为了下一步操作而产生的不完全匹配5端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启
10、动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲” 。很多时候 PCR 只是初步克隆，之后我们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在 PCR 这个步骤为下一步的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。a 添加限制性内切酶酶切位点添加酶切位点是将 PCR 产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的 5端还需要加 23 个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：Sal不需要保护碱基，EcoR需要 1个，Not需要 2 个，Hind 3 个。其中，在原核表达
11、设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考：原核表达之实验前的分析 。里面一些规则是所有表达都通用的。有一种做法是在进行 PCR 反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切酶在 PCR 反应中的酶切反应率，见附录。不过这种方法虽然方便但并不推荐。有时候，就是把 PCR 产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使出现问题的原因变得更加复杂。一旦出现问题，分析起来更麻烦。b LIC 添加尾巴LIC 的全称是 Ligation-Independent cloning，它是 Navogen 公司专门为其部分的 pET 载体而发明的一种克隆方法。用LIC 法制备的 pET 载体有不互补的 121
12、5 碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物 5序列要与 LIC 载体互补。T4 DNA 聚合酶的 35外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备好的插入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。c 定向 TA 克隆添加尾巴在 T 载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。但是后来人们发现 TA 克隆无法将片段定向克隆到载体中，所以后来 Invitrogen 推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基 GTGG。因此在 PCR 引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向
13、”了。d In-Fusion 克隆方法这项技术是 Clontech 还属于 BD 的时候推出的，2004 年在生物通可着实风光了一把，不但当选年度创新试剂还被大家投票为最受大家欢迎的试剂。此技术就其步骤来说是及其方便的，不需连接酶，不需长时间的反应。只要在设计引物的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将 PCR 产物和线性化的载体加入到含有 BSA 的 In-Fusion 酶溶液中，在室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量的转化。这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响，欢迎大家发 email 推荐给生物通。说不定你的推荐可以让它成为年度之星呢。如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个 PCR 反应，比如在加入 Not的酶切位点后整个引物的退火温度就会直线上升（它识别的是 8 个碱基，且全为 GC） ，这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温度相差不宜太远。因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。在碰到这些情况的时候，我们只能秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了。
