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1、微生物学,第四节 微生物培养法概论,一个良好的微生物培养装置的基本条件是：按微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和良好通气条件（只有少数厌氧菌例外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件和严防杂菌的污染等。,微生物的培养方法可分为八个大类,实验室的微生物培养法,好氧培养法,厌氧培养法,好氧菌液体培养法,好氧菌固体培养法,厌氧菌固体培养法,厌氧菌液体培养法,一、实验室培养法 （一）固体培养法 1.好氧菌的固体培养,试管斜面（test-tube slant） 培养皿琼脂平板（agar plate） 克氏扁瓶（kolle flask）
2、茄子瓶,2.厌氧菌的固体培养,实验室中 培养厌氧菌,特殊的培养装置或器皿,配制特殊的培养基,六种营养要素,加入还原剂和氧化还原势的指示剂,（4）厌氧罐（anaerobic jar）,（1）高层琼脂柱,（2）厌氧培养皿,（3）亨盖特滚管技术（hungate roll-tube technique）,（5）厌氧手套箱（anaerobic glove box）,厌氧菌固体培养的具体方法,大多数微生物都是好氧菌，微生物一般只能利用溶于水中的氧，要保证在培养液中始终有较高的溶解氧浓度。,（二）液体培养法 1.好氧菌的液体培养,一般情况下（1大气压， 20 ）下，氧在水中的溶解度仅为6.2mlL（0.28
3、mmol），这些氧只能保证氧化8.3mg（即0.046mmol）葡萄糖，仅相当培养基中常用葡萄糖浓度的1。氧的供应始终是好氧菌生长、繁殖中的限制因子。,一般可通过增加液体与氧的接触面积或提高氧分压来提高溶氧速率，具体措施有： 浅层液体静止培养； 将三角瓶内培养物利用往复式或旋转式摇床（shaker）作摇瓶培养（shake-flask cultivation）； 在深层液体培养器的底部通入加压空气，并用气体分布器使其产生均匀、密集的微小气泡； 对培养液进行机械搅拌，并在培养器的壁上设置阻挡装置等。,（4）台式发酵罐（benchtop fermentor）,（1）试管液体培养,（2）三角瓶浅层液体
4、培养,（3）摇瓶培养,实验室中常用的好氧菌培养法,2.厌氧菌的液体培养,实验室中对厌氧菌进行液体培养时，保证培养基的氧化还原电位（Eh）降至-150mV-420mV ，以适合严格厌氧菌的生长。,厌氧罐或厌氧手套箱,液体培养厌氧菌,不必提供额外的培养措施,单独放在有氧环境下培养,有机还原剂,加入能显著降低氧化还原电位的铁丝等,巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉等,加入,无机还原剂,用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油,二、生产实践中培养微生物的装置 （一）固体培养法 1.好氧菌的曲法培养,原始的曲法培养就是将麸皮、碎麦或豆饼等固态基质经蒸煮和自然接种后，薄薄的铺在培养容器表面，使
5、微生物既可获得充足的氧气，又可利于散发热量，对真菌来说，还十分有利于产生大量孢子。,曲（qu或mouldy bran）,根据制曲的容器形状和规模的大小分类,瓶曲,袋曲（用塑料袋制曲）,盘曲（用木盘制曲）,帘子曲（用竹帘子制曲）,转鼓曲（用大型木质空心转鼓横向转动制曲）,通风曲（厚层制曲）,机械化程度和生产效率较高的现代化制曲技术，酱油酿造业广泛使用。,食用菌制种和培养,挂曲,小 曲,红 曲,一般是由一个面积在10m2左右的水泥曲槽组成，槽上有曲架和用适当材料编织成的筛板，其上可摊一层约30cm厚的曲料，曲架下部不断通低温、湿润的新鲜过滤空气，制备半无菌状态的固体曲。,转鼓式自动固体培养装置 这
6、是以米为原料，米曲霉（ Asperigillus oryzae）固体培养生产日本酒曲的转鼓装置示意图。清洗、蒸煮、接种、固体翻松、水的喷淋、冷却、空气循环、过滤和排气等所有操作都在该装置上完成。,2.厌氧菌的堆积培养法,生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还不多见。在白酒生产中，一向用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵等都十分有利，可生产名优大曲酒（蒸馏白酒）。,（二）液体培养法 1.好氧菌的培养,（1）浅盘培养（shallow pan cultivation）,（2）深层液体通气培养,生产实践上对厌氧菌进行大规模固体培养的例子还不多见。在
7、白酒生产中，一向用大型深层地窖对固态发酵料进行堆积式固态发酵，这对酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵等都十分有利，可生产名优大曲酒（蒸馏白酒）。,（1）高层琼脂柱,把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，经灭菌后，除表层上有一些溶解氧外，越是深层，其氧化还原势越低，故有利于厌氧菌的生长。,例如，韦荣氏管（Veillon tube）是由一根长25cm、内径1cm，两端可用橡皮塞封闭的玻璃管，可作稀释、分离厌氧菌并对其进行菌落计数。,（2）厌氧培养皿, 利用特制皿盖去创造一个狭窄空间，加上还原性培养基的配合使用而达到厌氧培养的目的， 例如，Brewer皿, 利用特制皿底有两个相互隔开的空间，其
8、一放焦性没食子酸，另一则放NaOH溶液，待在皿盖平板上接入待培养的厌氧菌后，立即密闭之，经摇动，使两试剂接触而发生吸氧反应，从而造成无氧环境，,例如，Spray皿 或Bray皿,（3）亨盖特滚管技术（hungate roll-tube technique）,由著名美国微生物学家R.E.Hungate 于1950年分离瘤胃微生物和产甲烷菌等严格厌氧菌时设计的一种具有划时代意义的严格厌氧技术亨盖特滚管技术（Hungate roll-tube technique）。,（4）厌氧罐（anaerobic jar）,这是一种常规的但不很严格的厌氧菌培养技术，原因是它除能保证厌氧菌在培养过程中处于良好的无氧
9、环境外，无法使培养基配制、接种、观察、分离、保藏等操作也不接触氧气。,（5）厌氧手套箱（anaerobic glove box）,把含有还原剂的固体或半固体培养基装入试管中，经灭菌后，除表层上有一些溶解氧外，越是深层，其氧化还原势越低，故有利于厌氧菌的生长。,（1）试管液体培养,装液量可多可少。此法的通气效果不够理想，仅适合培养兼性厌氧菌。,（2）三角瓶浅层液体培养,在静止状态下，三角瓶内的通气状况与其中装液量和棉塞通气程度对微生物的生长速度和生长量有很大的关系。此法一般也仅适宜培养兼性厌氧菌。,（3）摇瓶培养,又称振荡培养，一般将三角瓶内培养液的瓶口用8层纱布包扎，以利通气和防止杂菌污染，同
10、时减少瓶内装液量，把它放到往复式或旋转式摇床上作有节奏的振荡，以达到提高溶氧量的目的。目前广泛地用于菌种的筛选以及进行生理、生化发酵和生命科许多领域的研究工作。,（4）台式发酵罐（benchtop fermentor）,这是一种利用现代高科技制成的实验室研究用的发酵罐，体积一般为数升至数十升，有良好的通气、搅拌及其他各种必要装置，并有多种传感器（sensor）、自动记录和用计算机的调控装置。现成的商品种类很多，应用较为方便。,（1）浅盘培养（shallow pan cultivation）,这是一种用大型的盘子对好氧菌进行浅层液体静止培养的方法。在早期青霉素和柠檬酸等发酵中，均使用过浅盘培养。
11、,缺点： 劳动强度大、生产效率低和产品易污染等，难以推广。,（2）深层液体通气培养,这是一类应用大型发酵罐进行深层液体通气搅拌的培养技术，它的发明在微生物培养技术发展史上具有革命性的意义，并成为现代发酵工业的标志。,发酵罐（fermenter或fermentor）是一种最常规的生物反应器（bioreactor），一般是钢质圆筒形直立容器，其底和盖为扁球形的，高与直径之比一般为122.5。容积可大可小，大型发酵罐的容积在50500m3，最大的为英国用于甲醇蛋白生产的巨型发酵罐，其有效容积达1500m3。,发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富而均匀的养料，良好的通气和搅拌，适宜的温度和酸碱度，并能确保防止杂菌的污染。为此，除了罐体有合理的结构（图7-17）外，还要有一套必要的附属装置，例如培养基配制系统，蒸气灭菌系统，空气压缩和过滤系统，以及发酵产物的后处理系统俗称“下游工程”（down-streamprocessing）等。,
