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1、药学论文-固相萃取作者：杨克迪，李宏，龙云飞，郑智慧，万顺刚 【关键词】 固相萃取；,高效液相色谱；,黄芪甲苷摘要：目的采用固相萃取高效液相色谱方法分析黄芪中黄芪甲苷的含量。方法采用 C18 固相萃取小柱纯化黄芪提取物中的黄芪甲苷，反相高效液相色谱紫外检测方法测定黄芪中黄芪甲苷含量。色谱柱为 Zorbax SBC18 柱（4.6 mm150 mm，5 m），以乙腈水（3268）为流动相，流速 1.0 ml/min，柱温 30，检测波长 200 nm。结果黄芪甲苷进样量在 1.4087.04 g 范围内与峰面积呈良好线性关系，r=0.999 9。平均回收率为 101.5%。结论该方法操作简便，重
2、现性好，可作为黄芪药材或其它含黄芪制剂中黄芪甲苷含量的分析方法。关键词：固相萃取； 高效液相色谱； 黄芪甲苷Abstract：ObjectiveTo establish SPEHPLC method for the determination of astragaloside IV in Radix Astragali. MethodsThe astragaloside IV in sample was purified with C18 solid phase column and its content was determined with HPLCUV method. The astr
3、agaloside IV was separated on a Zorbax SBC18 column (4.6 mm150 mm, 5 m) with acetonitrile-water (3268, v/v) as mobile phase, and the detective wavelength was set at 200nm. ResultsThe linear range was 1.4087.04 g (r=0.999 9). The average recovery of astragaloside IV was 101.5%. ConclusionThe method i
4、s simple, accurate and can be used for the quality control of Radix Astragali and its preparation.Key words：Solidphase extraction； HPLC； Astragaloside IV黄芪为常用中草药，具有较高的药用价值，其主要成分黄芪甲苷具有镇痛、镇静和降血压等药理活性1，2。2005 年版中国药典规定采用 HPLCELSE方法测定黄芪甲苷含量3，鉴于紫外检测器的普及性，目前相当部分实验室仍采用 HPLC-UV 法分析黄芪及相关制剂中黄芪甲苷含量48。由于黄芪甲苷的特征吸
5、收波长在 200 nm 左右， 样品中杂质对黄芪甲苷定量分析干扰较大。目前一般采用 D101 大孔吸附树脂处理样品，样品中仍含有较多的杂质，黄芪甲苷与其它杂质难以达到基线分离，影响分析准确度，另一方面也不利于色谱柱的保护。本文采用固相萃取方法纯化样品中黄芪甲苷，可明显去除样品中杂质，并以此测定了黄芪药材中黄芪甲苷含量。1 仪器与材料1.1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（美国Agilent 公司）；C18 固相萃取柱（美国 Bestown 公司）；Laborota 4000 旋转蒸发器（德国 Heidolph 公司）；BS124 S 电子分析天平（北京赛多利斯
6、仪器系统有限公司）；KQ500DB 超声波清洗机（昆山超声仪器厂）。1.2 药材与试剂黄芪购于南宁市一心药业公司，经鉴定均为药典正品；黄芪甲苷对照品购于中国药品与生物制品检定所（批号 0781200311）；乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯，双蒸水自制。2 方法2.1 对照品溶液的配制精密称取 17.6 mg 黄芪甲苷对照品置于 25 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。2.2 黄芪甲苷供试品溶液的制备取黄芪药材，粉碎。精密称取 4 g 粉末，用 20 ml 甲醇于索氏提取器中浸泡过夜，加甲醇至 60 ml，于水浴中 80下回流提取 4 h。提取液挥干甲醇，残渣用正丁醇饱和的水
7、10 ml 超声溶解，溶液用水饱和的正丁醇萃取 4 次，40 ml/次。合并正丁醇液，用 1%NaOH 溶液洗涤 3次，40 ml/次，然后用正丁醇饱和水洗至中性，回收正丁醇，残渣用 5 ml 水溶解，备用。C18 固相萃取柱依次用 5 ml 甲醇和 5 ml 水预处理，取黄芪甲苷水溶液过固相萃取柱，先用 3 ml 双蒸水洗涤，然后用 20%甲醇溶液 5 ml 洗涤，弃去洗涤液。用 60%甲醇 20 ml 洗脱，收集洗脱液。洗脱液挥干溶剂，用甲醇定容至 5 ml 作为供试品溶液。2.3 色谱条件 Zorbax SBC18 色谱柱 (4.6 mm150 mm,5 m)，流动相为乙腈水（3268，
8、v/v），流速 1.0 ml/min，柱温为 30，检测波长 200 nm。样品谱图见图 1，对照品谱图见图 2。2.4 样品含量测定2.4.1 线性范围考察用微量进样器分别取 2，4，6，8，10 l 黄芪甲苷对照品溶液进样。以黄芪甲苷对照品峰面积为纵坐标 y，黄芪甲苷对照品进样量为横坐标 x，进行线性回归，得回归方程：y=72.288 5 x-4.902 5 (n=5)，r=0.999 9，线性范围为 1.4087.04 g。2.4.2 黄芪甲苷含量测定分别测定了批号为 20050316，20051125 两批黄芪药材中黄芪甲苷的含量。结果见表 1。图 1 黄芪甲苷供试品液相色谱图（略）图
9、 2 黄芪甲苷标准品液相色谱图（略）表 1 黄芪中黄芪甲苷的含量测定结果（略）2.4.3 精密度实验精密吸取黄芪甲苷对照品溶液 10l，按 2.3 色谱条件重复进样 5 次，测定峰面积，黄芪甲苷峰面积 RSD=0.87%。2.4.4 加样回收率实验精密称取已知黄芪甲苷含量的黄芪 2.0 g，加入适量黄芪甲苷对照品，按 2.2 方法制备供试品溶液，按照 2.3 的色谱条件测定黄芪甲苷含量，计算黄芪甲苷平均回收率。结果见表 2。表 2 回收率实验结果（略）3 讨论3.1 中国药典及较多文献采用氨试液去除黄芪甲苷样品液中的酸性成分。作者参考文献4，对氨试液及 1%NaOH 溶液的去杂效果进行了比较，
10、通过观察处理后的样品液颜色及进行色谱分析。结果表明，1% NaOH 溶液洗涤效果较氨试液好，能更好地去除样品中黄酮等含酚羟基的酸性杂质。3.2 黄芪甲苷样品通常采用 D101 大孔树脂吸附纯化，HPLC 分析表明其纯化效果不理想，样品中杂质较多，黄芪甲苷峰与杂质峰不能得到基线分离。经比较，采用 C18 固相萃取柱纯化样品，得到的样品液干扰物较少，黄芪甲苷分离效果较好。3.3 实验探讨了黄芪甲苷样品的固相萃取方法和条件。黄芪甲苷的反向固相萃取优于正相固相萃取；样品负载在 C18 萃取柱上后，依次用 3 ml 水、20%甲醇溶液 5 ml 冲洗柱子，能有效地去除样品中极性杂质，然后采用 60%甲醇
11、 20 ml 可完全洗脱黄芪甲苷，所得样品液杂质相对较少，有利于样品分析。3.4 实验表明，黄芪甲苷样品经固相萃取处理，HPLC 分析结果具有较好的准确性和重现性，SPEHPLC 可作为黄芪或其它黄芪制剂中黄芪甲苷的含量分析方法。参考文献：1 张银娣，王幼林，沈建平，等黄芪皂苷甲镇痛、镇静作用J.南京医学院学报，1984，4（4）：225.2 张银娣，王幼林，沈键平，等黄芪皂苷甲的抗炎和降压作用J.药学学报，1984，19（5）：333.3 国家药典委员会中国药典，部 S.北京：化学工业出版社，2005：212.4 贺福元，刘平安，邓凯文，等反相高效液相色谱法测定大鼠血浆中补阳还五汤中黄芪甲苷的含量及药动学研究J.中国药学杂志，2005，41(21)：1647.5 伍 毅，郑国HPLC 测定复聪香液中黄芪甲苷的含量J.中国中药杂志，2005，30 (12)：945.6 张莲珠，汲立伟，吕雪峰HPLC 测定克尼胶囊中黄芪甲苷的含量J.中成药，2005，27 (8)：991.7 戴军平，刘秀霞，吴 沉，等HPLC 法测定黄芪口服液中黄芪甲苷的含量J.西北药学杂志，1998，14（4）：149.8 郭洪祝，刘晓峰，于 ，等高效液相色谱法测定胰复康胶囊中黄芪甲苷含量J.中国中药杂志，2000，25（10）：609.
