《叶酸降低高同型半胱氨酸大鼠主动脉内皮黏附分子VCAM【医学论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《叶酸降低高同型半胱氨酸大鼠主动脉内皮黏附分子VCAM【医学论文】（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、医学论文-叶酸降低高同型半胱氨酸大鼠主动脉内皮黏附分子 VCAM作者：黎明,陈健,冯义柏,李裕舒,谷翔,史春志 【关键词】 高同型半胱氨酸Folic acid reduces adhesion molecules VCAM1 expression on endothelium in rats with hyperhomocysteinemia【Abstract】 AIM: To investigate the effects of folic acid supplementation on the expression of adhesion molecules VCAM1 in aortic
2、 endothelium of rats with hyperhomocysteinemia (HHCY) induced by ingestion of excess methionine (MET). METHODS: Thirty male SD rats（20020 g）were divided into 3 groups (n=10 in each group): control group (Control), high MET group (MET) and MET plus folate group (METfolate). The rats were fed respecti
3、vely on normal diet, normal diet enriched by 17 g/kg MET and normal diet plus 17 g/kg MET and 0. 06 g/kg folate for 45 d. The levels of total plasma homocysteine (HCY) were detected and the expression of VCAM1 protein and mRNA in aorta of rats was detected respectively by immunohistochemistry and RT
4、PCR. RESULTS: The highmethionine diet resulted in a significant increase in the plasma HCY levels (140.736.9) mol/L vs (6.51.1) mol/L. The serum HCY levels were significantly lower in rats fed on highmethionine plus folaterich diet than those in rats fed on the highmethionine diet (50.621.8) mol/L v
5、s (140.736.9) mol/L, P0.05. The expression of adhesion molecules VCAM1 at protein and mRNA levels was higher in aortic endothelium of rats fed on the highmethionine diet than that in control rats. The expression of VCAM1 at protein and mRNA levels was significantly reduced in aortic endothelium of r
6、ats fed on highmethionine plus folaterich diet compared with that in rats fed on highmethionine diet. CONCLUSION: A high methionine diet for 45 d is sufficient to induce HHCY. Folate supplementation to the rats fed on the highmethenine diet prevents the elevation of HCY levels in the blood and reduc
7、es the expression of adhesion molecules VCAM1 in aorta of rats with HHCY.【Keywords】 hyperhomocysteinemia; adhesion molecules VCAM1; folate【摘 要】 目的：探讨叶酸治疗对高蛋氨酸(MET)喂养所致的高同型半胱氨酸(HHCY)血症大鼠主动脉内皮黏附分子 VCAM1 表达的影响. 方法: SD 大鼠 30只随机分 3 组: 正常对照组(Control 组), 高蛋氨酸组(MET 组)和蛋氨酸叶酸组(METFolate 组), 每组 10 只，分别给予普通饲料，普
8、通饲料加 17 g/kg 蛋氨酸，普通饲料加 17 g/kg 蛋氨酸和 0.06 g/kg 的叶酸，饲养 45 d，测定血浆总同型半胱氨酸浓度(HCY)，分别采用免疫组织化学染色法及 RTPCR 法检测大鼠的主动脉 VCAM1 蛋白及 mRNA 表达. 结果：高 MET 组血浆 HCY 浓度明显高于Control 组（140.736.9) mol/L vs (6.51.1) mol/L, P0.05，METFolate 组血浆 HCY 浓度明显低于高 MET 组（50.621.8) mol/L vs (140.736.9) mol/L, P0.05；在高 MET 组中，主动脉内皮表达的细胞黏附
9、分 VCAM1 在蛋白及 mRNA 水平均较 Control 组明显增加，而 METFolate 组减少蛋氨酸饮食诱导的 HHCY 血症所致的主动脉内皮表达的细胞黏附分子 VCAM1表达. 结论: 补充叶酸显着降低血浆 HCY 水平，也降低 HHCY 大鼠主动脉内皮细胞黏附分子 VCAM1 的表达.【关键词】 高同型半胱氨酸；黏附分子 VCAM1；叶酸0 引言高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia, HHCY）是心脑血管疾病的一个独立危险因素1,其可能机制有：氧化应激反应增强、NO 的生物活性降低及血栓形成2，3，然而，确切的分子机制仍不清楚. 离体实验证实 HCY能刺激
10、培养的单核细胞表达多种炎症趋化因子4，但在体 HHCY 血症能否增加趋化因子的表达报道甚少. 我们探讨 HHCY 是否通过细胞黏附分子 VCAM1 的参与而发挥致动脉粥样硬化作用效应，及叶酸治疗是否能下调这种炎症反应.1 材料和方法1.1 材料健康清洁级 SD 大鼠 30 只，雄性，体质量(20020)g(华中科技大学同济医学院动物实验中心提供)，随机分 3 组，每组 10 只: 正常对照组(Control 组), 蛋氨酸组(methionine,MET 组)，蛋氨酸叶酸组(METFolate 组). 对照组给予普通饲料，HHCY 组为普通饲料加 17 g/kg 蛋氨酸，叶酸治疗组为普通饲料加
11、17 g/kg 蛋氨酸和 0.06 g/kg 叶酸5，均饲养 45 d 后，心脏取血 10 mL,3000 r/min,离心 10 min,-20冻存.1.2 方法1.2.1 大鼠血浆总 HCY 测定取 3 组大鼠血样本 1 mL 交协和医院心血管研究所实验室采用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆总 HCY 浓度.1.2.2 大鼠的主动脉免疫组织化学染色分离 3 组大鼠的主动脉，取升主动脉组织送协和医院病理科行石蜡切片（5 m）. 将固定的主动脉石蜡切片立刻用 100 mL/L 马血清及 PBS 在室温下封闭 30 min. 加入 1100 羊抗大鼠 VCAM1多克隆一抗（Santa Cruz
12、） 50 L 孵育 1 h, 用 PBS 洗 3 次，每次 15 min. 加入 1250 的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗（Dako）孵育 1 h，用 PBS 洗3 次，每次 15 min. 用 900 mL/L 甘油 PBS 封片. 切片置于光学显微镜下观察并照相（200）.1.2.3 半定量 RTPCR 法检测大鼠的主动脉 VCAM1 mRNA 表达 组织总 RNA提取（Trizol 法）:Trizol RNA 提取试剂盒是美国 invitrogin 公司提供. 取大鼠新鲜主动脉组织 100 mg 置 1.5 mL 匀浆器中，加入 1 mL Trizol 充分匀浆，室温静置 5 min.
13、 加入 0.2 mL 氯仿，振荡 15 s，静置 2 min. 4离心，12 000 g15 min，取上清. 加入 0.5 mL 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10 min. 4离心，12 000 g10 min，弃上清. 加入 1 mL 750 mL/L 乙醇，轻轻洗涤沉淀. 4,7500 r/min5 min，弃上清. 晾干，加入适量的 DEPC H2O 溶解（65促溶 1015 min）. 抽提出的 RNA 经凝胶电泳鉴定 RNA 质量，紫外分光光度计 260 nm 和 280 nm 鉴定 RNA 的纯度; cDNA 第一链的合成: 将 RNA 15 g 加入微量离心管中，补充
14、适量的 DEPC H2O 使总体积达 11 L. 在管中加 10 mol/L Oligo(dT) 1218 L,轻轻混匀、离心. 70加热 10 min，立即将微量离心管插入冰浴中 1 min. 然后加入下列试剂的混合物：10PCR buffer 2 L，25 mmol/L MgCl2 2 L，10 mmol/L dNTPmix 1 L，0.1 mol/L DTT 2 L. 轻轻混匀，离心. 42孵育 25 min. 于 70加热 15 min 以终止反应. 将管插入冰中，加入 RNase H 1 L，37孵育 20 min，降解残留的 RNA. -20保存备用; 引物的设计与合成：VCAM1
15、 引物设计参照有关文献，经基因库核实，由上海生物工程公司合成. 上游引物为5GGAGACACTGTCATTATCTCCTG3，下游引物为5TCCTTTCATGTTGGCTTTTCTTGC3，扩增产物为 336 bp，采用为 actin 内参照，其上游引物 5CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3，下游引物为5GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3, 扩增产物为 506 bp; PCR 扩增：PCR 反应总体积 20 L，分别加入 10PCR buffer minus Mg 2 L, 25 mmol/L MgCl2 1.2 L, 10 mmol/L dNTP mix 0.4 L,
16、 5 mol/L 上游引物 0.8 L, 5 mol/L 下游引物 0.8 L, Taq DNA polymerase (11012/L) 0.8 L, cDNA 0.8 L, autoclaved distilled water 13.40 L. 94变性 3 min，94 45 s，58 45 s，72 1 min, 扩增 30 个循环，72延伸 10 min. VCAM1 和 actin 反应条件相同. PCR 扩增产物经 20 g/L 琼脂糖凝胶（溴化已锭染色）60 V 电泳 60 min，紫外灯下观察记录照相.统计学处理:用 SPSS 10.0 软件包进行统计分析. 各组间的数据采用单变量方差分析，方差齐性条件下选用 SNK 法进行两两比较，方差不齐时，采用GamesHowell 方法比较. P0.
