《海参钙离子通道基因的克隆与性质分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《海参钙离子通道基因的克隆与性质分析（49页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、研究生：杨冠科 指导教师：丛丽娜 教授,海参钙离子通道基因的克隆与性质分析,海参钙离子通道简介,论文的主要工作内容,结论与展望,海参（Sea Cucumber）,海参自溶现象，困扰生产商多年 养殖过程中遇到的诸多问题，持续出现 传统的理论解释和研究方法不能满足生产和科研的需要。 关键问题-海洋的高盐浓度及高压环境 盐离子浓度 离子通道,离子通道（Ion Channel）,钙离子通道,本文用分子生物学手段对海参体内的钙离子通道亚基基因进行了研究 用生物信息学手段对所得到的该基因全序列进行了性质分析,论文的主要工作内容,总RNA的提取 利用设计的简并引物进行RT-PCR 设计引物，进行3 RACE
2、 PCR 设计引物，进行5 RACE PCR 拼接全序列并进行生物信息学分析,总RNA的提取,TRIzol法,RT-PCR简并引物的设计,为了设计简并引物，我们比对了如下物种钙离子通道亚基的氨基酸序列： 合浦珠母贝(Pinctada fucata, GenBank accession number: EF154452) 紫色球海胆（Strongylocentrotus purpuratus, GenBank accession number: XM_785360） 锥实螺(Lymnaea stagnalis, GenBank accession number: AF484087) 人(Homo
3、 sapiens, GenBank accession number: BC075049) 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, GenBank accession number: AF000198) 牛（Bos Taurus, GenBank accession number: AF174417） 曼森血吸虫(Schistosoma mansoni, GenBank accession number: AY277532),目的：扩增海参的钙离子通道亚基的保守区,最终引物,HS4-1: 5-ARYAATGAYTGGTGGAT-3 HS4-2: 5-GCYTTYTGCAT
4、CATRTCT-3 注：R=A/G Y=C/T,RT-PCR结果,二次PCR结果,RT-PCR割胶回收及菌落PCR结果,割胶回收产物电泳图,菌落PCR产物电泳图,SjCa保守区测序结果,443 bp,SjCa保守区的BLASTX,长度为443 bp的产物,5 RACE实验,3 RACE实验,拼接,SjCa全序列,3 RACE 引物设计,3 RACE Outer Primer : 5- TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3 HS4-1-GSP1(Outer Primer) : 5-TTCACCCTGGCTAACTCACG-3 3 RACE Inner Primer : 5-CGCG
5、GATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3 HS4-1-GSP2(Inner Primer) : 5-GAATCGCTACGGAGAACGAAAAGTG-3,使用试剂盒：3-Full RACE Core Set Ver. 2.0 （TaKaRa）,3 RACE PCR结果,3Outer PCR,3Inner PCR,3RACE 割胶回收及菌落PCR结果,割胶回收产物电泳图,菌落PCR产物电泳图,SjCa 3 RACE测序结果,序列长为1019 bp 经过序列比对得到此序列的5 端与SjCa序列保守区的3 端有188个碱基重合，且有poly(A)尾 初步判断3 端的扩增是成功的
6、,5 RACE 引物设计,5 RACE Outer Primer: 5-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA- 3 HS4-1-GSP3 (Outer Primer): 5-AGGCGGTGTGTTATCAGATTGCT-3 5RACE Inner Primer: 5-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG- 3 HS4-1-GSP4 (Inner Primer): 5-GTGTCCCACTTTTCGTTCTCCGTAGC-3,使用试剂盒：5-Full RACE Kit（TaKaRa）,5 RACE PCR结果,5Inner PCR,5RACE 割胶回收
7、及菌落PCR结果,割胶回收产物电泳图,菌落PCR产物电泳图,SjCa 5 RACE测序结果,序列长为879 bp 经过序列比对得到此序列的3 端与SjCa序列保守区的5 端有281个碱基重合 因此可初步判断5 端是扩增成功的,把上述三段序列拼接并校正后，得到SjCa cDNA基因全长1867 bp 将该cDNA 序列提交至GenBank（GenBank accession number: EU853658）,SjCa的生物信息学分析,利用NCBI的ORF Finder分析，SjCa全长cDNA中，5 非编码区（UTR） 179 bp，3 UTR 74 bp，开放阅读框（ORF）长度1614 b
8、p，编码537个氨基酸 在3 端的非编码区中，距离poly(A)尾上游10个核苷酸的位置有推测的真核生物基因的多聚腺苷酸加尾信号（polyadenylation signal site）AATAAA的出现 SjCa的分子量预测值为59.8 kD，理论等电点为8.77，分子式为C2583H4151N771O834S13 Dipro软件分析表明,在该氨基酸序列中共有3个半胱氨酸残基，其中Cys410和Cys428之间可能会形成一个二硫键,ProtScale程序运算的结果显示： SjCa的第370位异亮氨酸（Ile）疏水性最强，第501位组氨酸（His）亲水性最强，大部分氨基酸属于亲水性氨基酸（分数
9、为负值），由此可以推测此蛋白可能为亲水性蛋白,SjCa包含有三个高度保守的功能区 位于D4区的VDCC 亚基结合相关的BID区（Lys250Phe290） 位于D2区能够调节激酶活性的SH3功能区（Val99Ser159） 位于D4区调节VDCC 亚基活性的GK功能区（Arg265Trp439）,D1,D2,D2,D3,D3,D4,D4,D4,D5,D5,BID,SH3功能区,GK功能区几乎是整个D4区,SjCa内的活性位点,9个 蛋白激酶C（PKC）磷酸化位点 Protein kinase C(PKC)phosphorylation sites 9个 酪蛋白激酶（CK2）磷酸化位点 Case
10、in kinase (CK2) phosphorylation sites 2个 cAMP依赖型蛋白激酶磷酸化位点 cAMP-dependent protein kinase phosphorylation sites,此图模拟SjCa部分氨基酸（Glu77His443）构成的三级结构。用箭头指出了氨基酸残基 Pro262，Pro266，Pro272 和Tyr277在此三维结构中的位置（因其可能为 亚基与 1亚基 重要的结合部位）。SjCa的SH3区和GK区均用白色表示。,SjCa中GK区（Arg265Trp439）的三级结构预测。图中BID区N端的序列用白色标出。此模型显示在这个重要的功能片
11、段中是由一个中央折叠和一个螺旋组成。,SjCa中SH3区（Val99Ser159）的三级结构预测,讨 论,SjCa具有其他VDCC 亚基共有的SH3区，GK区以及BID区 其他物种BID区中高度保守的序列PSMRP在SjCa中变成了PTIRP-这段保守序列中重要的氨基酸是PKC磷酸化位点SMR中的丝氨酸，而TIR中的苏氨酸也同样是PKC磷酸化位点，且二者都是中性氨基酸，因此推测这种变化并不会造成SjCa与其他物种的VDCC 亚基在功能的差异。 曼森血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本血吸虫（Schistosoma japonicum）和长枪乌贼（Loligo bleekeri
12、）等无脊椎动物亦有此现象。,结 论,首次从海参中克隆了电压依赖性钙离子通道亚基基因的全长cDNA序列，并由此推测出相应的氨基酸序列。所获得基因的cDNA全长1867 bp，包含一个开放阅读框1614 bp，编码537个氨基酸。 SjCa的分子量为59.8 kD，理论等电点为8.77，分子式为C2583H4151N771O834S13。 亲水性蛋白。,SjCa具有其他VDCC 亚基共有的SH3区，GK区以及BID区，虽在氨基酸上略有不同，但其功能却与其它的海洋棘皮动物比较相似。,致 谢,感谢丛丽娜教授、朱蓓薇教授、张宗申教授、侯英敏老师、王璐老师等老师的指导 感谢鄢荣歆、王秀霞、郝明、赵文超、王
13、雪霞、薛卫巍、田鹏玮、郭茵、边蕾、谢三群等同学的帮助 最后还要感谢一直支持着我的亲朋好友！,THANK YOU！,3RACE PCR 反应,5,3,mRNA,AAAA,TTTT,TTTT,AAAA,TTTT,5,3,3adaptor,outer primer,PCR反应,双链DNA,直接测序,已知序列特异性引物,Gsp1 Gsp2,3adaptor primer,inner primer,5RACE PCR 反应,5 m7G-P-P-P,AAA 3,5 m7G-P-P-P,AAA 3,AAA 3,TAP,HO-P,5adaptor,RT,AAA 3,5,5,Gsp1 已知序列特异性引物,5ou
14、ter primer,mRNA,cDNA,Random 9 mers,使用5RACE方法扩增5端序列,3 完整的RNA,不完整的RNA,3,3,P,P,去磷酸化酶（CIAP）,去“帽子”酶（TAP）,P,5RACE Adaptor,TAP()反应：检验去磷酸化的反应不彻底造成假阳性,3 完整的RNA,不完整的RNA,3,3,P,P,去磷酸化酶（CIAP）,去“帽子”酶（TAP）,5RACE Adaptor,M-MLV()反应：检测染色体DNA造成的假阳性,3 完整的RNA,不完整的RNA,3,3,P,P,反转录酶M-MLV,P,5RACE Adaptor,Protein kinase C （ Ser/Thr-X-Lys/Arg ） Casein kinase II （ Ser/Thr-X-X-Asp/Glu） cAMP-dependent protein kinase （Lys/Arg-Lys/Arg-X-X-Ser/Thr）,
